Подготовка образцов для растровой (сканирующей) электронной микроскопии

Основные этапы подготовки биологических объектов к РЭМ: 1) предфиксационная обработка; 2) фиксация; 3) обезвоживание; 4) высушивание; 5) покрытие объекта слоем металла. Этапы подготовки биологических объектов под номерами 1, 2, 3 соответствуют пробоподготовке к ПЭМ, а 4 и 5 хотя и похожи, но имеют свою специфику.

В настоящее время основными методами для высушивания клеток и тканей являются высушивание переходом критической точки и замораживание-высушивание.

Высушивание переходом критической точки осуществляют при помощи специальных устройств. Такой аппарат имеет герметически закрытую камеру с входным и выходным клапанами, а также снабжен устройствами для охлаждения, подогрева, регистрации температуры и давления.

Рис. 42. Аппарат для замещения жидкости переходом критической точки (фирмы Hitachi).

Биологический объект, погруженный в промежуточную или дегидрирующую жидкость (ацетон), вносят в предварительно охлажденную (до 10—15°С) камеру, в которую затем впускают СО₂; углекислый газ конденсируется в жидкость. Затем камеру нагревают до температуры выше температуры равновесия жидкость – пар (примерно до +42° С). С подъемом температуры возрастает и давление в камере. По достижении критической точки жидкий СО₂ переходит в газообразное состояние. Пока температура поддерживается выше температуры равновесия, это состояние сохраняется и газ может быть выпущен из камеры, объект становится высушенным.

Замораживание-высушивание. Это быстрое замораживание биологического объекта с последующей сублимацией льда в условиях высокого вакуума. Используя криогенные агенты (фреон 12, пропан, азот) замораживание объекта происходит без образования ледяных кристаллов, вся клеточная жидкость одновременно во всех частях объекта переходит в некристаллическое (аморфное) состояние. Образование кристаллов льда при замораживании клеточных объектов резко снижается в случае предварительного замещения воды в объекте этанолом, ацетоном, амилацетатом или фреоном 113. Замороженные объекты, покрытые тонким слоем жидкого азота, в металлических контейнерах помещают в специальную герметизированную камеру, предварительно охлажденную до -60….-80°С, в которой создается высокий вакуум. В случае замораживания обводненных объектов время, требуемое для их высушивания, варьирует от нескольких часов (изолированные клетки) до нескольких суток (тканевые фрагменты размером 1—3 мм); если же вода в объекте была предварительно замещена органическим растворителем, то процедура высушивания уменьшается. По окончании сушки камере дают постепенно нагреться до почти комнатной температуры, а затем на короткое время нагревают ее до 30°С, после чего впускают в камеру воздух (нагревание должно предотвратить конденсацию влаги из воздуха на объекте). Высушенный объект приобретает высокую гигроскопичность, его быстро переносят в камеру для покрытия металлом.

Рис. 43. Вакуумная напылительная установка (фирмы JEOL). В такой установке производят сублимацию жидкости из биологических объектов и напыление на их поверхность металлов.

Покрытие биологических объектов металлом производится в специальной вакуумной камере и может быть осуществлено двумя способами: путем испарения нагреваемого металла и путем «выбивания» атомов металла, бомбардируемого ионами инертного газа. Напыление биологических объектов слоем металла вызывает увеличение интенсивности излучения вторичных электронов и предотвращает образование электрических зарядов на поверхности объекта, все это способствует достижению более высокого разрешения. Наряду с этим нанесенный слой металла приводит к стабилизации поверхности образца, и снижению нагрева возникающего в результате взаимодействия электронного зонда с объектом. Слой металла должен быть сплошным и иметь всюду одинаковую толщину независимо от расположения и ориентации отдельных элементов рельефа поверхности объекта. Толщина слоя металла может варьировать от 5 нм до 20 нм. С целью более равномерного покрытия, а также для исключения эффекта «оттенения» объект на протяжении всей процедуры покрытия подвергают наклонам и вращению, со сменой его ориентации относительно источника испаряющихся атомов металла. Достижению равномерности покрытия металлом (особенно объектов с очень сложной конфигурацией поверхности) способствует предварительное покрытие поверхности объекта тонким слоем углерода. Благодаря способности к рассеиванию атомы углерода легко проникают во все труднодоступные участки рельефа. Непрерывный слой углерода механически стабилизирует поверхность объекта, защищает ее от атмосферной влаги и является адгезивной подложкой для следующего покрывающего слоя — металла. Для создания покрытия используют тяжелые металлы и их сплавы: Аu, Pt, Ag, Au/Pd, Pt/Pd. Все они хорошо эмитируют вторичные электроны, легко испаряются при нагревании и стабильны в обычной атмосфере (кроме Аg).