Основы молекулярной биотехнологии - I

Традиционные методы селекции. Методы селециии микроорганизмов

Селекция (от латинского selectio – выбор, отбор) – практические приемы и методы выведения новых и улучшения существующих сортов растений и пород животных и получения полезных видов микроорганизмов, дающих при определенных условиях наибольшее количество полезной для человека продукции. Селекционные объекты получают на основе двух свойств – изменчивости и наследственности. Теоретической основой селекции является генетика. В результате селекции получают мутанты, наследственность которых изменена.

Методы селекции

Метод спонтанных мутаций.Так были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских дрожжей, уксуснокислых, пропионовокислых бактерий и др. Однако частота спонтанных мутаций невелика. Чтобы возникла мутация ген должен удвоиться 10⁶ - 10⁸ раз.

Индуцированный мутагенез. Для его проведения используются следующие подходы:

· в протоке лимитируется количество какого-либо субстрата. Так, если в среде культивирования E. coli уменьшается содержание лактозы, то это приводит к накоплению мутантов с более высокой активностью b-галактозидазы, вследствие амплификации генов лактозы;

· применяют физические мутагены, которые способны повреждать ДНК (ультрафиолетовое, рентгеновское или g-излучение);

· используют химические мутагены: ингибиторы предшественников нуклеиновых кислот (азогуанин, азосерин, кофеин); аналоги азотистых оснований нуклеиновых кислот (5-бромурацил, 5-хлорурацил, 2-аминопурин); алкилирующие соединения (диметилсульфат, окись пропилена, фенол, формальдегид);

· используют биологические факторы (фаги).

После получения мутаций отбирают наиболее продуктивные клоны, которые вновь подвергают воздействию тех или других мутагенов и т.д., т.е. проводят ступенчатый отбор по интересующему признаку. Однако этот метод трудоемок и не позволяет достоверно судить о характере возникших изменений.

Метод отбора продуцентов по их устойчивости к структурным аналогам целевого продукта.Метод основан на регуляции активности ферментов по принципу обратной связи. Так, микроорганизмы синтезируют азотсодержащие соединения только из глюкозы и ионов аммония. При добавлении в среду культивирования, например, аминокислоты синтез аминокислот прекращается. У сверхпродуцентов фермент сохраняет свою активность и не реагирует на ингибирующее действие конечного продукта, или синтез фермента оказывается устойчивым к избытку продукта или его аналога. Так, мутантные клеточные клоны моркови устойчивые к этионину (аналог метионина) синтезировали в 20 раз больше метионина, а резистентные к 5-метилтрипрофану – в 30 раз больше триптофана.

При селекции микроорганизмов необходимо учитывать ряд их особенностей:

· каждая клетка при выращивании образует клон, т.е. совокупность генетически однородных особей. Однако, вследствие естественных мутаций, в клоне развивается гетерогенность и он превращается в популяцию (совокупность клеток с разными генотипами);

· у микроорганизмов нет скрытой изменчивости;

· для микроорганизмов не характерно половое размножение, поэтому селекцию клеток можно проводить только вегетативным путем;

· отбор положительных мутантов проводится быстрее и эффективнее благодаря быстрой смене поколений микроорганизмов.

Для селекции микроорганизмов используют музейные культуры, известные промышленные продуценты или выделяют микробы из природных субстратов.

Главные этапы селекции микроорганизмов: выбор объекта селекции; получение ценного продуцента; мутагенез; рекомбиногенез (скрещивание, слияние клеток, генная инженерия, конъюгация, трансформация, трансдукция); отбор (естественный, искусственный); стабилизация свойств штаммов, полученных в результате селекции; консервация.