Конструирование рекомбинантной ДНК

Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных био­логических источников. Соединение фрагментов ДНК в единую молекулу производится несколькими методами, в зависящими от того, какие концы фрагменты сшиваемых ДНК.

Соединение фрагментов по одноименным «липким» концам.Некоторые рестриктазы разрывают молекулу ДНК, образуя симметричные ступеньки, разрыв находится на одинаковом расстоянии центра от сайта узнавания. Эти комплиментарные друг другу участки могут соединяться за счет спаривания комплиментарных оснований. Но любые два фрагмента независимо от происхождения, образовавшиеся под действием одной рестриктазы могут «слипаться» за счет образования водородных связей между комплиментарными основаниями. Однако после такого соединения целостность двойной спирали не восстанавливается, поскольку остается два разрыва в фосфодиэфирном остове. Полная целостность спирали восстанавливается только при действии ферментов ДНК-лигаз, т.е. ДНК-лигазы завершают образование рекомбинантной ДНК

Соединение фрагментов по «тупым» концам.«Тупые» концы фрагментов ДНК, полученные после действия рестриктаз соединяются также за счет ДНК-лигаз. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке «липкими» концами.

Однако «липкие» концы можно ферментативным путем присоединить к «тупым». Для этого используют фермент – концевую трансферазу из тимуса теленка. Процесс сшивки завершается действием ДНК-лигазы.

Соединение фрагментов с разноименными липкими концами.

В ситуации, когда необходимо соединить фрагменты ДНК, имеющие некомплиментарные нуклеотиды, применяют так называемые линкеры(или «переходники». Линкеры – это химически синтезируемые олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикации или их комбинации.

Существуют линкеры «тупой конец – липкий конец». При необходимости липкие концы можно «затупить». Это достигается отщеплением нуклеотидов «липких» концов с помощью нуклеаз, либо «липкие» концы «застраивают», т.е. с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых «липких» концах синтезируют вторую нить. Таким образом, из фрагмента ДНК с «липкими» концами получается фрагмент с «тупыми», и он соединяется с другим фрагментом ДНК с «тупыми» концами ДНК-лигазой.

После соединения фрагментов рекомбинатной ДНК, ее нужно ввести в живую клетку. Делают это при помощи так называемых векторов.

Векторы ГИ

Вектор - саморегулирующаяся (автономная) молекула ДНК, используемая в ГИ для переноса генов и др. последовательностей от организма донора в организм-реципиента, а также для клонирования последовательностей нуклеотидов.

Благодаря молекулам векторов стало возможным введение в живую клетку рекомбинантной ДНК. Дело в том, что при обычном введении ДНК, например, в бактериальную клетку, она, как правило, атакуется ферментами, которые гидролизуют ее до нуклеотидов. Иногда ДНК «выживает», но при делении клеток такая ДНК не наследуется и теряется. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала частью генетического аппарата клетки, она должна встроиться в геном клетки и реплицироваться в ней.

В качестве векторов используют плазмиды, бактериофаги, вирусы животных и др. Первые векторы - плазмиды были выделены из бактерий. В последующем большинство векторов конструировались методами ГИ.

Векторы бывают следующих типов:

1. Векторы для клонирования - используют для увеличения (амплификации) фрагмента ДНК, встроенного в такой вектор посредством репликации. К таким векторам относят бактериальные плазмиды и фаги, для клонирования больших участков используют искусственные бактериальные и дрожжевые хромосомы.

2. Экспрессионные векторы. Их используют для анализа последовательностей генов и их белковых продуктов, так как в данных векторных молекулах гены имеют внешнее фенотипическое проявление. Таких векторов огромное множество, они есть в клетках дрожжей, растений и млекопитающих. В эукариотических клетках такие векторы всегда содержат экспрессионную кассету.

3. Векторы для трансформации. Их используют для введения чужеродного фрагмента ДНК в геном реципиента.

Современные векторы обычно полифункциональны, т.е. совмещают в себе несколько функций.

Обычно в состав вектора входит маркерный ген, который проникая в клетку, придает ей специфический фенотип, свидетельствующий о присутствии определенного вектора. Часто в качестве маркерных используют гены устойчивые к антибиотикам. Белок этих генов, как правило, может дезактивировать действие антибиотика.

Требования к векторной молекуле:

1. Вектор должен содержать уникальный сайт рестрикации для нескольких рестриктаз, что позволит встроить в него фрагмент чужеродной ДНК;

2. Вектор должен иметь определенную емкость и не абортировать встроенный фрагмент;

3. Вектор должен реплицироваться в определенных клетках за счет имеющейся точки начала репликации (ориджина);

4. Вектор должен содержать маркерный ген, облегчающий селекцию клеток, несущих ген.