Способы культивирования микроорганизмов

Культивирование – это процесс выращивания микроорганизмов в (на) питательной среде, в результате которого происходит размножение, накопление их биомассы и продуктов метаболизма (продуктов микробного синтеза).

Глубинный метод культивированиязаключается в выращивании микроорганизмов в жидкой питательной среде.

Преимущества глубинного культивирования продуцентов:

1. Позволяет получать бактериальную массу за короткое время.

2. Процесс легко управляем из-за высокой степени автоматизации.

3. Позволяет легко корректировать рН среды в ходе культивирования посредством дополнительного внесения питательных веществ, особенно углеводных и биологических стимуляторов.

4. При данном способе выращивания максимальные результаты культивирования легко воспроизводимы.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в аппаратах-культиваторах (биореакторах) складывается из следующих этапов:

- получение посевного материала;

- приготовление питательных сред;

- стерилизация питательных сред;

- очистка воздуха до и после аэрирования;

- производственное культивирование.

1. Получение посевного материала.Для засева питательной среды посевной материал готовят также глубинным способом. Вид посевного материала зависит от вида микроорганизма: для грибов и актиномицетов – это мицелиальная вегетативная масса, а для бактерий – молодая растущая культура на начальной стадии спороношения.

Получение посевного материала осуществляется постадийным увеличением массы микроорганизмов в четыре ступени:

- исходная культура продуцента;

- маточная культура, выращенная в колбах на качалке;

- посевная культура, выращенная в инокуляторе;

- посевная культура, выращенная в посевном аппарате.

Объем посевного материала зависит от физиологических особенностей продуцента. Он резко возрастает, до 5-20 %, если продуцент размножается только вегетативно, и сокращается до 1 %, если культура спороносящая. Объем посевного аппарата составляет до 10 % от объема промышленного ферментера. При использовании слишком молодой культуры процесс получения посевного материала значительно удлиняется.

2. Приготовление питательных сред.В промышленных условиях питательные среды обычно готовят в отдельном цехе, чтобы загрязненное микроорганизмами сырье не попало в основное производство. Среды готовят в емкостях, снабженных механическими мешалками, добавляя в определенной последовательности растворимые (соевая мука, кукурузная мука, мел) компоненты. При необходимости отдельные компоненты дополнительно обрабатывают: измельчают, просеивают, отваривают, экстрагируют. Поэтому цех для приготовления питательных сред должен быть оборудован теплообменниками, дозаторами, размельчителями, экстракторами, варочными котлами, аппаратами для гидролиза. Для лучшего растворения среду нагревают до 70-80ºС острым паром.

3. Стерилизация питательных сред. Приготовленную питательную среду стерилизуют двумя способами – отделением микроорганизмов от среды или уничтожением их в среде. Перспективнее первый способ, поскольку при любом методе уничтожения микроорганизмов происходит частичное разрушение питательных компонентов среды.

Первый способ проводят с помощью полупроницаемых мембран в процессе микрофильтрации. Второй метод стерилизации проводят с помощью высоких температур.

Стерилизацию питательных сред можно проводить периодически и непрерывно. При периодическом способе процесс ведут в самом ферментере, куда заливают питательную среду, нагревают ее до температуры стерилизации, выдерживают при этой температуре нужное время и охлаждают. При непрерывном способе предварительно стерилизуют аппараты и коммуникации проточным паром, затем подают в ферментер среду, которая прошла через нагревательную колонку, где нагрелась острым паром до 120-140 ºС, выдерживатель, где находилась нужное время при температуре стерилизации и холодильник, где охладилась до температуры культивирования.

Отдельно от среды периодическим способом стерилизуют пеногаситель и все корректирующие растворы.

4. Очистка воздуха до и после аэрирования.Атмосферный воздух содержит частицы пыли органической и неорганической природы, капли воды и микроорганизмы в количестве до 10 ⁵ частиц на 1 м³. Стерильность его достигается фильтрацией через объемные волокнистые фильтры. Обычно необходима двойная очистка – на головном фильтре, затем на индивидуальных фильтрах непосредственно перед вводом воздуха в посевные и производственные ферментеры.

После аэрирования производственной культуры газовый поток, отводимый из ферментера, несет с собой клетки продуцента. Их отлавливают фильтрами на отводящем воздухоносе.

5 Производственное культивирование.Биосинтез веществ глубинным способом протекает достаточно быстро. Продолжительность выращивания микроорганизмов в культиваторе 18-24 часа, для спорообразующих она колеблется от 40 до 250 часов (для актиномицетов и микроскопических грибов) при непрерывной подаче воздуха (кроме анаэробов) и перемешивании.

Высокие концентрации питательных веществ на первых этапах могут тормозить рост биомассы микроорганизмов. Поэтому питательная среда вводится в ферментер постепенно на стадии активного роста. Большинство продуцентов являются мезофильными микроорганизмами и оптимум их развития находится при температуре 22-32 ºС. Почти все быстро инактивируются при повышении температуры сверх оптимальной.

Процесс культивирования контролируют по изменению температуры, рН, расходу воздуха, частоте вращения мешалки, содержанию кислорода, а также путем периодического отбора проб (через 1-12 часов). В пробах определяют содержание углеводов, общего и аминного азота, наличие посторонней микрофлоры, исследуют морфологию микробных клеток.

Глубинный способ выращивания микроорганизмов может быть как периодическим, так и непрерывным.

При периодическом способепродуценты выращивают в какой-либо среде без ее смены, загружая в биореактор весь объем питательной среды и посевного материала (инокулят) одновременно. Процесс ведется до образования определенного количества биомассы или продукта метаболизма.

Непрерывное культивирование, в отличие от периодического, имеет явные преимущества и является более перспективным. Сущность его заключается в том, что в ферментаторе (биореакторе) поддерживаются постоянные условия среды, в результате чего микроорганизм остается в определенном физиологическом состоянии.

Рис. 3. Кривая роста микроорганизма