МЕТОД РІВНОВАЖНОГО ДІАЛІЗУ

Суть методу полягає в тому, що антиген вносять у дві камери, розділені напівпроникною мембраною (а) Між ними вста­новлюється концентраційна рівновага (досить довготривалий процес –до 24 год). Це один із недоліків методу, також треба враховувати неспецифічну сорбцію на поверхні мембрани.

За відсутності антитіл, ліганд, доданий в камеру В, проникає через мембрану у камеру А, таким чином встановлюється рівновага (рис. 6.2 а).

За умови експерименту проводили внесення антитіл до каме­ри А, а радіоактивно мічені антигени, які є достатньо малими для можливого проникнення через мембрану, до камери В. Ініціюється переніс вільного антигену із камери В в камеру А і встановлюється рівновага.

В цьому випадку антигени, проникаючи у камеру А, зв’язуються з активними центрами антитіл, в той час як незв’язані ліганди рівномірно розподіляються між обома камерами. Отже, загальна концентрація антигена буде вищою у камері А (рис.б), а різниця між концентраціями антигена в обох камерах після встановлення рівноваги і є величиною В з рівняння Скетчерда= концентрація антигена, зв’язаного з антитілами [АГ·АТ]. Величина незв’язаного антигена в обох камерах –це (F ). При тому, що концентрація антитіл в камері є відомою , можна визначити κ_а : κ_{а =} В/ F · (n –B).

Самі значення В і Fможна оцінити шляхом повтору методу рівноважного діалізу з однаковою концентрацією антитіл, але з різними концентраціями антигенів (дописати з паперового варіанту).

Суттєвим недоліком методу є те, що він використовується лише для визначення концентрації низькомолекулярних антигенів (гаптенів), які вільно проникають через мембрану. Саме та­ким чином було вперше розраховано Кa для мієломних антитіл.

Флуоресцентні методи, зокрема метод гасіння флуоресценції, використовують тоді, коли зв'язування антигена змінює оптичні параметри антитіл, наприклад, гасить флуоресценцію залишків триптофану в активному центрі. Для білків це спостерігається при Е збудження 280 нм, а Е емісії- 330-360 нм. Кожному значенню концен­трації антигену відповідає своє значення флуоресценції і можна роз­рахувати концентрації вільного і зв'язаного антигену. Переваги- простота і швидкість (до 30 хв), недоліки-тільки чисті АТ і строгі вимоги до структури досліджуваних антигенів.

Таким чином, у представлених вище методах, вимірявши концентрацію вільного і розрахувавши (вимірявши) концентрацію зв’язаного антигену у декількох точках титрування антитіл антигеном, будують графік Скетчарда згідно із рівнянням Скетчарда та визначають як Ка ,так і розраховують навіть концентрацію антитіл.

Аналізуючи взаємодію АГ-АТ треба обов’язково зазначити:

1) Оптимальна концентрація солей для таких реакцій є 0.85%, а іонна сила розчинів – 0.1-0.5. Значне підвищення концентрації солей приводить до розпаду комплексів АГ- АТ, так 15% розчин NaCl використовують для отримання компонентів реакції у вільному стані.

2) Сила зв’язування не порушуються за значень рН в інтервалі 6.4-8.6. При зміні рН вище 9.0, чи нижче 5.0 відбувається зсув реакції в сторону дисоціації комплексів, що також використовують при елюції антитіл чи антигенів.

3) Оптимальною для взаємодії температурою є 37⁰С, проте утворення комплексів АГ-АТ відбувається досить ефективно і при більш низьких температурах. Наприклад, реакції аглютинації (для первинного тестування) ставлять при кімнатній (18-20⁰С) температурі. Підвищення температури до 40 ⁰С не впливає на ефективність взаємодії, проте вже підвищення до 60⁰С стимулює розпад комплексів. Вважають, що температурний параметр реакції більше залежить від антитіл, ніж від антигенів, оскільки у ссавців виявлено ходові антитіла, які взаємодіють з антигенами тільки при температурі нижче 37⁰С та можуть бути причиною розвитку гемолітичної анемії, якщо є аутоантитілами.

4) При постановці реакцій АГ-АТ in vitro видимі результати виявляються не відразу, а через певний проміжок часу. Тому реакцію АГ-АТ умовно поділяють на дві частини – фазу взаємодії та фазу проявлення. Умовність цього поділу полягає в тому, що власне взаємодія між пара- топом АТ та епітопом АГ є досить швидким процесом, проте до кінця фази проявлення може пройти від кількох хвилин до декількох діб.

Методи визначення Кa є частиною великої групи методів вивчен­ня взаємодії антигену з антитілом, які використовуються також для визначення присутності і кількості антигенів і антитіл у біологічних сумішах. Вони необхідні, наприклад, для діагностики різних фізіоло­гічних станів організму. Так, діагностика вагітності - це часто визна­чення трофобласт-специфічного глобуліну у крові чи сечі жінки. Діаг­ностика багатьох ендокринних порушень потребує точного визначен­ня рівня того чи іншого гормону. При інфаркті міокарду однією із най­більш ранніх ознак некротичного процесу, що відбувається, є поява в крові міоглобіну серцевого м'язу, рівень якого корелює із об'ємом ура­ження. Використання для цього саме імунохімічних методів є пере­важним, оскільки вони базуються на високій специфічності взаємодії антиген-антитіло. Використання моноклональних антитіл дозволило максимально стандартизувати ці методи, зробити їх надійними та відтворюваними. З іншого боку, визначення антитіл у сироватках чи інших біологічних рідинах теж часто є необхідним, наприклад, для оцінки успішності вакцинації. Визначення антитіл проти віруса СНІДу є головним діагностичним тестом на зараження цим вірусом. Таким чином, визначення антигенів та антитіл часто є необхідним у клінічній практиці. Воно потребує дуже чутливих методів, тому що більшість гормонів, ростових факторів та антитіл знаходяться в організмі у слі­дових кількостях. Саме тому в останні десятиріччя багато уваги при­ділялося розробці чутливих методів кількісного та якісного визначення антигенів і антитіл.