Гетерогенних (поліклональних, Б) антитіл

Уявимо, що до розчину антитіл у надлишку ми поступово додаємо антиген. При цьому спочатку весь антиген зв'язується і [F] « [В]. По мірі до­давання антигену [В] збільшується, але збільшується і [F], тому співвідношення [В]/[F] зменшується. Графічно це виражається як лінійна залежність В/F від B, і κ_а може бути розраховано як тангенс ку­та нахилу прямої.

Пояснення цього феномену проілюстровано на рис.

Згідно з запропонованим рівнянням, графік Скетчарда - це пря­ма лінія. Рис. (А).На практиці при знаходженні константи цим способом проводять серію дослідів по визначенню рівноважної концентрації вільного антигену чи комплексу при різних початкових концентраціях антигена і постійній концентрації антитіл в системі.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

Проте більшість природних антигенів не є моновалентними, а містять декілька епітопів, а антитіла, в свою чергу, містять як мінімум два антигензв’язуючі центри, тобто є полівалентними по відношенню до антигенів. Тому за фізіологічних умов для опису більш складного процесу взаємодії полівалентного антигену із полівалентним антитілом використовують не афінність, а інтегральну усереднену величину спорідненості антигену до антитіла, яка називається авідністю або функціональною афінністю. Отже при аналізі сироваткових антитіл виявилося, що графік Скетчарда, побудований за експериментальними даними, має нелінійну форму (тобто по мірі зростання концентрації антигену κ_а зменшується) РИС (Б).Це явище пов'язане із гетерогенністю сиро­ваткових антитіл. Сироваткові антитіла - це суміш антитіл із різною афінністю до антигену.

Коли ми додаємо до розчину антитіл перші порції антигену, в реакцію вступають найбільш афінні антитіла, для зв'язування яких потрібна найменша концентрація антигену. По мірі зростання концентрацій антигену його починають зв'язувати все менш афінні антитіла, і реальний графік Скетчарда - це інтегральна крива κ_а усіх популяцій сироваткових антитіл (а їх може бути до 300 на одну антигенну детермінанту).

Прямий, класичний вид графіка Скетчарда можна отримати тільки для моноклональних (мієломних чи гібридомних) антитіл.

Авідність також залежить від спорідненості індивідуальних антигензв’язуючих центрів до епітопів даного антигену, але завжди буде вищою за суму афінностей, що до неї входять. Тобто, авідність залежить як від афінності, так і від кількості активних центрів на одну молекулу АТ.

Для поліклональних антитіл ∆F₁ +∆F₂ ⁼ - RТ (ln k₁+ ln k2)= -RT ln(k1∙ k2)

Для зв'язування двох антигенних детермінант двома активни­ми центрами антитіл сумма звільненої енергії пропорційна сумі лога­рифмів, тобто величини Ка не складаються, а перемножуються.

Полівалентність АГ і АТ суттєво посилює міцність їх з’єднання, оскільки для дисоціації імунних комплексів необхідно розірвати відразу всі зв’язки.

Підвищення авідності при мультивалентному зв'язуванні антиге­ну з антитілом має велике фізіологічне значення для підвищення ефективності зв'язування бактерій, їх токсинів, вірусів і т. і.

На сьогодні існує ряд методів визначення афінності антитіл та авідності сироваток. Процедура кожного із них полягає у тому, щоб спочатку створити умови, коли взаємодія антитіл з антигеном досягне рівноваги АГ + АТ = АГАТ, а потім, не порушуючи цієї рівноваги, виміряти концентрацію вільного та зв’язаного антигену.

Далі, використовуючи одержані дані, можна розрахувати константу афінності κ_а. Якщо половина антигензв’язуючих центрів буде зв’язана із антигеном, тобто [АТ] буде дорівнювати [АТАГ], значення константи афінності буде дорівнювати 1/[АГ]згідно з рівнянням =

Для зв’язування 50% активних центрів у випадку високоафінних антитіл (ті, що мають високу κ_а) достатньо низької концентрації антигену, а у випадку низькоафінних антитіл потрібна висока концентрації антигену.

Експериментальні підходи, які використовуються в імунохімічних методах

· До першої групи належать методи, коли розділення вільного і зв’язаного антигену відбувається за допомогою методів центрифугування або фракційного осадження, гель-фільтрації, діалізу.

· Друга група включає методи, що базуються на зміні фізико-хімічних властивостей антигенів під час утворення комплексу із антитілами. Це зміна флуоресценції, зміна ступеня поляризації флуоресценції і т.д.

Методи фракційного осадження використовуються для розділення комплексів АГ-АТ і антигенів, що не зв’язалися. Вони засновані на здатності високомолекулярних комплексів АГ-АТ вибірково осаджуватися різними реагентами (сульфатом амонію, етанолом, вторинними антитілами, поліетиленгліколем). Після встановлення в системі рівноваги осаджуючий реагент додають в такій концентрації, при якій комплекс АГ-АТ і антитіла, що не зв’язалися стають нерозчинними і випадають в осад, який і видаляється шляхом центрифугування.