Экспериментальное тестирование предсказанных соединений

Технология SBDD дает набор молекулярных струк­тур, ранжированных по неким виртуальным парамет­рам, но не может ответить на вопрос о возможном биологическом эффекте данных соединений. Поэтому любое компьютерное предсказание необходимо про­верять в реальных экспериментах по оценке биологи­ческой активности найденных или сконструированных и синтезированных соединений. На первом этапе обычно применяют различные тесты in vitro, которые позволяют быстро оценить способность потенциаль­ных лигандов взаимодействовать с макромолекулой-мишенью. Для этих целей предпочтительно использо­вать высоко-эффективные системы, основанные на прямом измерении взаимодействия лигандов с мише­нями в реальном времени с определением кинетиче­ских, равновесных и термодинамических параметров. Кроме того, могут быть использо­ваны разнообразные модели in vivo - от культур клеток до беспозвоноч­ных или «гуманизированных» мышей.

2.4.2. Разработка лекарств на базе соединений – лидеров.

Завершающая стадия создания лекарственного соединения - его разработка. На этой стадии оптимизированный лидер улучшают таким образом, чтобы он стал удобным для клинического использования и приобрёл нужные фармакокинетические характеристики (растворимость в воде, высокую биохимическую стабильность, пролонгированность действия). Как правило, на этой стадии структуру соединений снова изменяют, иногда очень существенно. При этом стараются без крайней необходимости сильно не увеличивать молекулярную массу лекарства, по сравнению с массой молекулы соединения – лидера. Опыт модифи­кации таких сложных природных веществ, как мор­фин, хинин или алкалоиды кураре свидетельствует, что нередко можно получить более простые аналоги исходного соедине­ния-лидера, сохраняющие его биологическую актив­ность. На этом этапе используется много методов с красивыми названиями: создание биоизостеров, пролекарств, пептидомиметиков, “мягких”(soft drug) и “двойных”(twin drug) лекарств и т. д.

Пролекарства - это вещества, не обладающие выраженной физиологической активностью, но способные превратиться в лекарства уже в организме человека. Происходит это в результате либо ферментативной реакции, либо химической (без участия белкового катализатора). Чтобы получить пролекарство, обычно модифицируют какую-то реакционно-способную группу в физиологически активном соединении так, чтобы эта связь разрушалась в организме. С помощью пролекарств можно, например, продлить действие препарата, повысить его растворимость в воде и даже изменить его вкус.Например,азатиопринявляется пролекарством 6-меркаптопурина, обладающего цитостатическими и иммунодепрессивными свойствами. В организме азатиоприн медленно превращается в 6-меркаптопурин, что приводит к пролонгированию действия последнего.

азатиоприн 6-меркаптопурин

Важный методом этого этапа является так называемая изостерическая или биоизостерическая замена. Термин „изостеры“ был введён ещё Ирвингом Ленгмюром в начале XX века: „Молекулы или ионы, которые содержат одинаковое число атомов и имеют одинаковое количество и расположение электронов“. Соответственно изостерическая замена в конструируемом лекарстве - это замена атома или группы на похожую по размеру или валентности. Если при этом сохраняется физиологическая активность, то замена называется „биоизостерической“. Интересно, что термин „биоизостер“ относится и к соединениям, получающимся путём замены на совершенно „непохожие“ группировки, но с сохранением биологических свойств (рис. 7). С помощью биоизостерической замены исследователям удаётся, например, уменьшить токсичность активного соединения, повысить его растворимость и устойчивость к действию ферментативных систем организма и т. д.

Рис.7. Примеры группировок, которые кажутся „непохожими“ на карбоксильную группу (–СООН), но, тем не менее, часто используются вместо неё при биоизостерической замене

Одним из перспективных направлений в создании новых типов лекарственных препаратов является использование соединений, называемых „пептидомиметиками“ и “пептоидами”.

Многие из ферментных субстратов, например ангиотензиноген, ангиотензин, фибриноген (как пред­шественник фибрина), белки вируса иммунодефицита GAG и GAG-POL (предшественники протеазы и дру­гих белков ВИЧ) и многие лиганды ферментов и ре­цепторов, такие как серпины, энкефалины, нейрокинины, соматостатин, фибриноген, витронектин и другие, являются либо низкомолекулярными пептидами, либо белками. В отличие от взаимодействий белок-белок в сигналь­ных цепях, взаимодействие этих лигандов с их био­мишенями осуществляется с помощью небольшого участка поли­пептидной цепи, содержащего всего несколько ами­нокислот, а остальная часть полипептида или белка стабилизирует определенное пространственное распо­ложение данной части макромолекулы. Показатель­ным примером этого может служить пептидный мотив RGD (аргинин, глицин, аспартат), который взаимо­действует с различными интегриновыми рецепторами в совершенно разных конформациях.

Если создаваемое нами лекарство должно подействовать на мишень, природный лиганд для которой такой пептид, то этот пептид можно взять в качестве соединения-лидера. Однако пептиды в качестве лекарств не слишком удобны: плохо растворяются в воде, легко расщепляются протеолитическими ферментами организма.

Поэтому на основе такого пептида создается лекарство- пептидомиметик - соединение, способное взаимодействовать с той же мишенью, но содержащее различные непептидные (неприродные) структурные элементы. Пептидомиметики способны копировать или противодействовать биологической активности природных белковых молекул, аналогами которых они являются..

По своей структуре пептидомиметики могут представлять собой полипептидную цепочку, построенную из молекул неприродных α-аминокислот или D-изомеров природных. Введение таких аминокислот (особенно α,α-дизамещенных) в ключевые позиции биологически активных пептидов, как правило, приводит к существенному повышению протеолитической и конформационной стабильности, селективности действия и улучшению фармакокинетических параметров потенциальных лекарств. Пептоидыпредставляют собой полипептиды полученные из молекул глицина, у которых один атом водорода в аминогруппе замещен на различные радикалы.

В принципе, пептидомиметики вовсе не обязательно должны иметь классическую полипептидную структуру. Главное, чтобы они могли эффективно имитировать полипептидный лиганд и обладать высоким сродством к биомишени. Поэтому в структуры пептидомиметиков часто вводят различные фрагменты - заместители и функциональные группы никогда не встречающиеся в природных полипептидах, которые являются биоизостерическими аналогами определенных участков природных пептидов.

Результатом успешного применения пептидомиметического подхода являются некоторые искусственные лиганды интегринов. Сначала была выявлена селективность цик­лических пептидов по отношению к соответствующим интегриновым рецепторам, а затем уже на их основе были сконструированы бензодиазепиновые пептидомиметики с превосходной селективностью. Другим примером удачного превращения пептидов в пепти-домиметики являются аналоги лигандов рецепторов нейрокинина-1 и нейрокинина-2 и лиганды рецепто­ров соматостатина с резко выраженной селективно­стью к определенным их подтипам.

Методом пептидомиметического моделирования также удалось получить ряд ингибиторов протеазы ВИЧ, исходя из последовательности сайта расщепле­ния. Первые лекарства этого типа против ВИЧ - саквинавир, ритонавир и индинавир - еще очень похожи на пептиды, а более новые аналоги, полученные путем структурного дизайна, - нелфинавир, ампренавир, а также пока не выпущенные на рынок ингибиторы, разработанные фирмой «DuPont», уже являются настоящими пептидомиметиками.

нелфинавир ампренавир

«Мягкие лекарства» - физиологически активные соединения, фармакологический эффект которых локализован в определенном месте. Распределение в других местах приводит к их быстрой деструкции или инактивации. «Мягкие» лекарства представляют собой активные производные неактивных аналогов лекарств. Например, такими являются эфиры кортикостероид-21-карбоновых кислот, которые активны при местном применении, но после всасывания через кожу очень быстро метаболиче­ски разлагаются до неактивных 21-кислот. Другим примером являются лекарства против глаукомы.

«Двойные лекарства» - физиологически активные соединения, содержащие две фармакофорные группы, объединенные ковалентно в одну молекулу. Это препятствует образованию молекул соли при комбинации двух лекарств. Примером идентичного двойного лекарства, представляющего собой комбинацию двух одинаковых составляющих может быть симметричная молекула BDHP. Активность BDHP приблизительно в десять раз выше, чем активность составляющих ее молекул нитрендипина (антагониста кальциевых каналов).

нитрендипин

Двойные лекарства могут быть и неидентичными (имеющими в качестве составляющих различные структуры). В частности, возможно конструирование сложных «бинарных» структур, содержащих в своем составе несколько функционально значимых частей молекулы.

Создание лекарств-клонов.Копирование существующих лекарств с незначи­тельными химическими изменениями (создание ле­карств-клонов) получило название исследования «mе too». Такие аналоги иногда могут иметь существенные терапевтические преимущества, по сравнению с уже существующим лекарством. Примером являются, различные биодоступные и устойчи­вые к лактамазе пенициллины широкого спектра дей­ствия, диуретические и противодиабетические суль­фамидные препараты на основе антибактериальных сульфамидов. Если лекарство «me too» имеет некоторое терапевтическое преимуще­ство, то оно, как правило, выдвигается на первое ме­сто, например, более популярным стал ранитидин по сравнению с циметидином или эналаприл по сравне­нию с каптоприлом.

Биологическая активность энантиомеров: хиральный переход.В прошлом хиральные лекарства получались в виде рацематов или (при наличии в молекуле нескольких хиральных центров) в виде диастереомерных смесей. Лишь около 20 лет назад фармаколог Арене подверг рацематы критике как вещества, «содержащие 50% примесей». Это подтолкнуло фармацевтическую промышленность к осознанию проблемы, связанной с тем, что оптически активное лекарство и его зер­кальный изомер могут значительно различаться по биологической активности. Действительно оказалось, что некото­рые хиральные барбитураты в одной из форм обла­дают седативной активностью, тогда как другой их энантиомер вызывает судороги. В случае синтетиче­ских аналогов морфина один энантиомер может быть сильным анальгетиком, а другой - противокашлевым средством. Некоторые дигидропиридины в од­ной энантиомерной форме являются блокаторами кальциевых каналов, в то время как другой оптиче­ский изомер стабилизирует кальциевый канал в от­крытом состоянии, так что в результате биологические эффекты в таком рацемате компенсируются. Другой пример дает печально известный препарат талидомид. Два его энантиомера обусловливают соот­ветственно седативную активность и побочное терато­генное действие, однако разделение рацемата не при­водит к продуктам с индивидуальной активностью из-за метаболической взаимотрансформации обоих энан­тиомеров.

В течение последнего десятилетия компаниям уда­лось продлить «время жизни» своих хиральных ле­карств с помощью так называемого «хирального пере­хода», когда на рынок поступает био­логически активный энантиомер вместо рацемата. Примерами подобной стратегии являются дексфен-флурамин (изъят из продажи в 1997 г.), дексибупрофен, декскетопрофен, левофлоксацин, левалбутерол, левобупивакаин, эзомепразол, левоцетиризин, дексметилпенидат и эсциталопрам.

«Спасение» плохих соединений-лидеров: метаболический переход.Иногда соединения-лидеры имеют настолько пло­хие свойства, что ни классическая оптимизация, ни получение пролекарства не в состоянии повысить их терапевтические возможности. Тем не менее, такие соединения можно «спасти», если понятны их биохи­мические механизмы действия, путем выбора их мета­болического предшественника либо активного метабо­лита неактивного или токсичного лекарства. Приведены ниже отдельные успешные приме­ры, подтверждают, что «плохие» соединения-лидеры действительно можно трансформировать в ценные лекарства.

Так фенацетин десятилетиями использовался как мяг­кое анальгетическое и жаропонижающее средство до тех пор, пока при длительном приеме не была обна­ружена его гепато- и нефротоксичность, и это лекар­ство было изъято из продажи. На смену ему пришел активный метаболит фенацетина - парацетамол, не образующий токсичных продуктов.

Занамивир - первый ингибитор нейраминидазы, используемый для лечения гриппа, является на­столько полярным соединением, что возможно лишь его ингаляци­онное применение. Анализ химической структуры не привел к изысканию никакого разумного способа его трансформации в орально активную форму лекарства. В то же время случайно обнаруженное сохранение биологической активности у аналогов, не содержащих характерной глицериновой боковой цепи сиаловой кислоты, привело к созданию орально доступ­ного препарата осельтамивира, который представляет собой пролекарство (этиловый эфир) липофильного аналога переходного состояния.