Регулируемые промоторы

Наиболее широко для создания экспрессирующих векторов используются следующие сильные регулируемые промоторы: промоторы lac- и trp-оперонов Е.coli; специально сконстру­ированный tac-промотор, состоящий из отдельных фрагментов lac- и trp-оперонов и ряд других. С каждым из них связываются соответствующие репрессоры, ко­торые опосредуют включение и выключение транскрипции специфических генов.

В отсутствии лактозы в среде lac- промотор Е. coli находится в репрессированном состоянии и транскрипция его гена блокирована. Индукция, или включение lac- оперона происходит при добавлении в среду лактозы. Аналогично, активность trp-оперна регулируется добавлением триптофана.

Другим способом регулирования экспрессии является использование термочувствительных промоторов, например промотор бактериофага рL. Белок- репрессор, блокирующий данный промотор, активен при 31⁰С, но неактивен при 38⁰С, следовательно, при инкубировании бактерий при 31⁰С клонированный ген не экспрессируется и, наоборот повышение температуры вызывает инактивацию репрессора и высокий уровень синтеза нужного белка. Это очень удобно, т.к. позволяет управлять процессом культивирования продуцента, проводя его наработку при 31⁰С и вызывая синтез целевого продукта только при достижении оптимального состояния культуры (стадия роста, плотность), путем повышения температуры до 38⁰С.

Наличие регулируемых промоторов позволяет предотвращать преждевременный, бесконтрольный синтез неконститутивных рекомбинантных белков, который будет тормозить рост клеточной культуры в lag- и log-фазах и запускать его только после накопления необходимого, оптимального количества биомассы клеток (в стационарной фазе).

Суммарная активность экспрессируемого гена возрастает с ро­стом числа копий рекомбинантной ДНК в расчете на клетку. Ис­пользуя многокопийные плазмиды, можно обеспечить сверхсинтез нужных белковых продуктов. Поэтому получение бактериаль­ных штаммов-сверхпродуцентов - одна из важ­нейших задач современной биотехнологии в экономическом, ме­дицинском и социальном аспектах. Обычно используемые сейчас плазмидные векторы поддержива­ются в клетке в количестве 20-50 копий и это не предел. Так в лабораторных условиях получены температурно-чувствительные мутантные плазмиды, способные накопить до 1- 2 тыс. ко­пий на клетку без нарушения жизненно важных функций бакте­рий. Естественно, подбор условий культивирования для таких продуцентов играет решающее значение.