Технология конструирования и работы с рекомбинантными ДНК

Сущность генетической инженерии сводится к целенаправ­ленному конструированию искусственных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и, кроме того, они привно­сят в него новые генетические и физиолого-биохимические свой­ства, полезные для человека. К числу таких свойств можно отне­сти синтез аминокислот и белков, гормонов, ферментов, вита­минов и др. Источником генетического материала могут выступать различные организмы не способные в обычных, природных условия, к обмену генетической информацией с организмами - реципиентами.

В настоящее время не существует единого, универсального набора методик, но чаще всего эксперименты с рекомбинантной ДНК проводят по следующей схеме.

1.Из организма - донора нужных генов - экс­трагируют нативную ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК-мишень, чу­жеродная ДНК), подвергают ее избирательному фермента­тивному гидролизу по определенным участкам (расщепляют, разрезают) с помощью соответствующих рестриктаз и соединяют (лигируют, сшивают) с другой ДНК (вектор для клонирования, клонирую­щий вектор) с образованием новой, рекомбинантной молекулы (конструкция «клонирую­щий вектор - встроенная ДНК»).

2. Эту конструкцию вводят в клетку-хозяина (реципиент), где она реплицируется и пере­дается потомкам. Этот процесс называется трансформацией.

3.Идентифицируют и отбирают клетки, несу­щие рекомбинантную ДНК (трансформиро­ванные клетки).

4.Получают специфический белковый про­дукт, синтезированный клетками-хозяевами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Рассмотрим эти процессы поподробнее.

Расщепление ДНК в специфических участкахнуклеотидных последовательностей осуществляется особыми бактериальными внутриклеточными ферментами - рестрикцирующими нуклеазами, способными разрушить чужерод­ную ДНК.

Каждый фермент, способный разрушить чужеродную ДНК, опознает в ней специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов. Соответствующие последовательности в геноме продуцирующих их бакте­рий замаскированы метилированием остатков дезоксирибозы с помощью ферментов-метилаз.

Согласно номенклатуре, предло­женной X. Смитом и Д. Натансоном, название рестриктазы складывается из трех букв: первая обозначает ро­довое название, две последующие - первые буквы вида.

Например, фер­мент из Е. coliобозначают как Есо или из Haemophilus influenzae - Hin и т.д. Типовая или штаммовая идентификация следует за родовидовой, например, EcoRI или Hindll и т. д. В настоящее время различные фирмы выпускают более 100 разнообразных ферментов, опознающих различные последовательности нуклеотидов. Для каждого конкретного фермента они различаются по длине, первичной структуре и способу разрыва молекулыДНК. Подавляющее большинство ферментов разрывает только двунитевую ДНК с образованием серии фрагментов, называемых рестрикционными (или рестриктами) с тупыми либо липкими концами).

Если рестриктазы вносят разрывы вдве цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов то на концах фрагментов образуются короткие одноцепочечные участки, способные образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента (“лип­кие концы”). Если разрыв происходит без смещения, то образуются фрагменты ДНК c “тупыми концами”.

Один из важнейших этапов конструирования молекулы рекомбинантной ДНК является лигирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК-лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, может проходить как по “липким”, так и по “тупым” концам. Однако эффективность сшивки по “тупым” концам ниже чем по “липким”.

-- -- АТГЦААТТ ЦАГТЦ-- -- -- --ГЦГГ ЦЦГТ-- --

-- -- ТАЦГ ТТААГТЦАГ-- -- -- --ЦГЦЦ ГГЦА-- --