Не только антибиотики: новые способы борьбы с микробами

Как и целая куча других химикатов, бактериофаги чертовски похожи на живые организмы. Большинство бактериофагов, если посмотреть на них в электронный микроскоп, напоминают головастых пауков или, может быть, лунные модули. Когда фаг поджимает свои членистые “ноги”, его “хвост” соприкасается с клеточной стенкой бактерии.

И по нему вирус вводит в клетку гены, которые превратят ее в фабрику по производству фагов. Вирусы, заражающие растения и животных, напоминают просто шарики из жеваной бумаги и представляют собой гены в белковой оболочке, которые садятся на поверхность клетки, и она по ошибке поглощает их.

В более сложном устройстве бактериофагов нет ничего удивительного, если принять во внимание, что их гонка вооружений с бактериями началась задолго – возможно, за несколько миллиардов лет – до появления на Земле любых других форм жизни. Столь долгой эволюцией может объясняться и то, что бактериофаги – самые разборчивые из всех вирусов на планете. Многие из них заражают не просто определенный вид бактерий, а лишь несколько избранных штаммов. До появления молекулярно‑генетических методов эта разборчивость давала микробиологам удобный способ определять штаммы бактерий и отличать их друг от друга. Например, штамм золотистого стафилококка 80/81, по чьей вине в пятидесятые годы погибали дети, был назван так за свою восприимчивость к бактериофагам № 8о и 81 из набора, в котором их было больше сотни.

В наши дни особую известность бактериофагам принесли популярные статьи вроде той, что вышла в журнале Wired под заголовком “Почему прожорливые советские вирусы спасут мир?” (подзаголовок: “Они завтракают бактериями, устойчивыми к антибиотикам”)45. Романтическим историям об открытиях, связанных с бактериофагами, и о способах их применения посвящены многие десятки журнальных статей, документальных телефильмов и книг, от статьи Питера Радетски “Хороший вирус”, опубликованной в 1996 году в журнале Discover, до вышедшей в 2006 году книги Томаса Хойслера “Вирусы против супермикробов”.

История медицинского применения бактериофагов началась в 1916 году, когда французско‑канадский микробиолог Феликс д’Эрелль впервые выделил их из образца стула и канализационной воды и продемонстрировал, что эти вирусы способны расти только внутри бактерий, которых они при этом эффективно убивают. В том же году д’Зрелль разработал фаговое средство для лечения шигелезз (бактериальной дизентерии). На Западе его исследования не нашли широкого признания, и в 1933 году д’Эрелль покинул Йельский университет и поехал в Тбилиси, где при его участии один из его бывших подопечных, Георгий Ииава, организовал на щедро выделенные Сталиным средства целый институт для изучения бактериофагов. Хотя сам Зяиава вскоре попал в опалу и в 1937 году был расстрелян, методы фаговой терапии успешно развивались за железным занавесом и использовались там в качестве дешевой альтернативы антибиотикам. В России и Грузии фаговые средства от расстройств кишечника, инфекций мочевых путей и ряда других распространенных заболеваний по‑прежнему можно купить в аптеке, а тбилисский институт, теперь носящий имя его основателя, остается мировым центром разработки методов фаговой терапии. Но денег на исследования в этой области всегда выделялось мало, и с распадом СССР 0 1991 году институт оказался почти без средств. Поэтому строгие доказательства эффективности фаговой терапии так и остались в лучшем случае скудными.

Честь возрождения исследований фаговой терапии на Западе во многом принадлежит Александру (Сандро) Сулаквелидзе – грузинскому специалисту по молекулярной биологии, ставшему в 1993 году научным сотрудником Медицинской школы Мэрилендского университета. В то время его руководитель Гленн Моррис пытался найти способ остановить нарастающие вспышки инфекций, вызываемых устойчивыми к ванкомицину энтерококками в университетской больнице в Балтиморе. “Может быть, попробовать использовать фагов?” – предложил Сулаквелидзе.

Фаги казались несравненным лекарственным средством: действуя лишь на узкий круг мишеней, они сулили мало вреда нормальной микрофлоре человеческого организма и были совершенно безвредны для его собственных клеток. Более того, в любой воде, загрязненной канализационными стоками, можно было найти нескончаемую череду разнообразных фагов, чтобы выявить среди них наилучшего или наилучших для лечения любой конкретной инфекции. К 1996 году Моррис и Сулаквелидзе уже собирали фагов в Балтиморской гавани и докладывали на медицинских конференциях результаты экспериментов, проведенных пока в пробирках, в лабораторных условиях.

Сказать, что эти идеи вызвали интерес, значит ничего не сказать. К 2002 году уже больше двух дюжин новых биотехнологических компаний стремились первыми начать клинические испытания средств фаговой терапии, участвуя в бурной гонке, с которой могла сравниться лишь поднятая в прессе шумиха по поводу того, что называли “забытым средством Сталина”. Среди пациентов, зараженных неизлечимыми бактериальными инфекциями, возникло что‑то вроде культа, вызвавшего появление в прессе новой волны статей – о том, как отчаявшиеся люди отправлялись в Тбилиси за средствами, недоступными на Западе. В 2003 году ньюаркская газета Star‑Ledger рассказала историю Кевина Смилли, тридцатисемилетнего американского инженера, страдавшего от мучительного бактериального синусита, возбудители которого оказались устойчивы ко всем антибиотикам. Поиск в интернете по запросу “альтернативы антибиотикам” привел его в тбилисский институт. Там ему хирургическим путем вживили пропитанные фагами “биодермные” полоски – в операционной, где за месяц до этого во время операции с потолка упала единственная лампа верхнего света. “Только быстрота реакции одного из врачей спасла от катастрофы, – писала репортер Эми Эллис Натт, – и на протяжении оставшейся операции ему пришлось самому держать лампу над пациентом”. Смилли получил месячную передышку, после чего, уже по возвращении в США, его болезненная инфекция возобновилась. В конце статьи сообщалось, что Смилли теперь принимает один из новых антибиотиков и планирует совершить новую поездку в Тбилиси. (С тех пор у него диагностировали одну из форм иммунодефицита, делающую его предрасположенным к хроническим инфекциям.)

Смилли отнюдь не одинок в своей стойкой вере в возможности фаговой терапии. Но прошло уже больше десятка лет с тех пор, как на Западе поднялась шумиха вокруг фагов, а популярных статей о средствах фаговой терапии по‑прежнему намного больше, чем научных публикаций. Некогда обширный круг компаний, проводящих исследования в этой области, сократился до пяти или шести, и ни одна из них еще не перешла к испытаниям на пациентах. В конце 2006 года одна компания (Intralytix, основанная Моррисом и Сулаквелидзе) получила одобрение Управления пищевых продуктов и медикаментов на использование первого фагового препарата – пищевой добавки, уничтожающей содержащихся в мясе листерий.

Почему же прогресс в этой области отнюдь не оправдал первоначальных надежд? Во‑первых, ученых всегда передергивало, когда о фагах говорили, что они “совершенно безвредны”. Хотя фаги действительно вездесущи (когда мы облизываем губы, около миллиона фагов может попадать нам в рот), для терапевтического применения их необходимо очищать и сгущать до концентраций намного более высоких, чем любые встречающиеся в природе. Не может ли такая пилюля из концентрированных вирусов, при всей их безвредности для человеческих клеток, запустить опасную иммунную реакцию? Судя по данным нескольких небольших испытаний, скорее всего нет. Но есть и другие потенциальные опасности. “Почти все разновидности токсинов, производимых болезнетворными бактериями, связаны с генами, передаваемыми фагами, – говорит Винсент Фискетти, исследующий этих вирусов с шестидесятых годов. – Вот что делают фаги. Переходя от одного хозяина к другому, они подхватывают и переносят гены”. Токсины, выделяемые микробами при дифтерии, холере, некротическом фасциите и вызываемых кишечной палочкой геморрагических инфекциях, все кодируются фагами, превратившими некогда безвредных микробов в патогенных убийц.

Сулаквелидзе и многие другие поборники фаговой терапии отвергают эту опасность как легко преодолимую. “Мы исследуем геномы наших фагов на предмет генов токсинов и чего угодно другого, чего нам не хотелось бы передавать, и просто не используем тех, у кого эти гены есть”, – говорит Сулаквелидзе. Если учитывать, что в каждом ведре загрязненной воды содержатся миллионы фагов, может показаться, что эта задача проста. Но даже самый “чистый” фаг вполне способен подхватить какие‑нибудь новые нехорошие гены – особенно если применять его против супермикробов, несущих немало такой опасной ДНК. Чтобы снизить риск, добавляет Сулаквелидзе, нужно тщательно отбирать фагов, почти или совсем не склонных встраиваться в хромосомы хозяев.

Проблема, предупреждает Фискетти, состоит в том, что мы по‑прежнему еще очень далеки от полного понимания процессов перетасовки генов бактериофагами. В частности, Фискетти и его коллега Томас Броуди недавно показали, что фаги, кодирующие токсины, в пробирке ведут себя совсем не так, как в организме животного. Если поместить нетоксичный штамм пиогенного стрептококка в пробирку вместе со штаммом, несущим кодируемый фагом токсин, это ни к чему не приведет. Но если нанести оба штамма на горло мыши или поместить их в культуру клетку человеческого горла, то кодирующие токсин фаги будут время от времени перескакивать на нетоксичных стрептококков, делая из них патогенных микробов. Хотя Фискетти весьма увлечен идеей использования фагов, он склонен проявлять осторожность в отношении их терапевтического применения: “Мы просто не можем сказать, что произойдет, когда мы сконцентрируем этих вирусов и будем применять и* для борьбы с патогенными микроорганизмами”.

Помимо проблемы безопасности на пути методов фаговой терапии стоят и практические затруднения. Поскольку иммунная система узнаёт в бактериофагах вирусов, она быстро очищает от них организм. Утверждают, что советские ученые еще на раннем этапе исследований в этой области добились определенных успехов в решении проблемы, многократно вводя животным некоторый набор фагов и выделив ряд вирусов, по каким‑то причинам сохраняющихся в крови в течение нескольких дней. Однако таких неуязвимых для иммунной системы фагов пока не удалось выделить среди тех, что известны своей способностью поражать болезнетворных бактерий. Поэтому даже в Восточной Европе успешное использование фагов всегда ограничивалось средствами, которые не должны поглощаться организмом, например кишечными “смывателями”, направленными на возбудителей поноса, таких как шигеллы или сальмонеллы, а также пропитанными фагами полосками, которые можно накладывать на раны или слизистые оболочки, как это сделали в зараженных носовых пазухах Кевина Смилли.

Еще одно препятствие состоит в том, что бактерии быстро вырабатывают устойчивость к фагам, чего и следовало ожидать, учитывая продолжительность их совместной истории. Поэтому лекарственные средства на их основе должны представлять собой разнообразные “коктейли” что, во‑первых, делает эти средства менее специфичными (увеличивая угрозу сопутствующего ущерба миκрофлорe а во‑вторых, затрудняет их проверку на предмет безопасности. Наконец, фаговые средства почти невозможно патентовать. Фармацевтическая компания может запатентовать определенный коктейль из фагов, но ничто не помешает другой компании смешать еще один коктейль, немного отличающийся от первого. “Без патентов очень сложно добиться от кого‑нибудь вложения миллионов в исследования и разработки, – говорит Фискетти. – Такое дело начинает казаться безрассудством”.

Быть может, самой резкой критике фаговая терапия подверглась в 2004 ГОДУ» когда Стивен Проян, начальник отдела антибактериальных исследований фармацевтического гиганта Wyeth, отметил, что за столетие изучения фаговых методов терапии на подопытных животных была опубликована всего одна статья, в которой была показана польза от такой терапии. “Это молчание о многом говорит, – писал Проян в научном журнале Nature Biotechnology. – Надо признать, что собственные истории, рассказываемые пациентами, которым якобы помогла фаговая терапия, одновременно забавны и печальны, потому что те, кому не удалось вылечиться от инфекции, своих историй по понятным причинам не рассказывают”. Параллели с такими модными лекарствами, как развенчанное “средство от рака” амигдалин, напрашиваются еще настойчивее, если почитать в интернете рекламу, зазывающую пациентов в Тбилиси на лечение в любой из множащихся там центров фаговой терапии или в готовящуюся к открытию дочернюю клинику в мексиканском городе Тихуана.

И все же даже такие критики фаговой терапии, как Проян, и такие осторожные ее сторонники, как Фискетти, готовы согласиться, что исследования в этой области могут рано или поздно привести нас к важным новым подходам к борьбе с бактериальными инфекциями. Проян как специалист по разработке лекарств считает перспективными исследования в следующем связанном с фагами направлении. Фаги заражают бактерий, пронзая доспехи бактериальной клетки в уязвимых местах, отмечает он. Так почему бы не использовать фагов в поисках новых мишеней для противомикробных препаратов? Монреальская компания PhogeTech работает именно в этом направлении, анализируя крошечные геномы фагов, которые заражают стафилококков, и изучая белки, используемые этими фагами для захвата аппарата копирования генов и синтеза белков в клетках этих микробов.

Тем временем сотрудникам лаборатории Фискетти в Рокфеллеровском университете удалось выделить некоторые из ферментов, производимых бактериальной клеткой по указке бактериофагов, когда они заканчивают размножаться у нее внутри. Эти ферменты заставляют клетку совершить что‑то вроде харакири: ее оболочка разрывается и новые фаги выходят наружу, заражая другие клетки и повторяя цикл. Фискетти установил, что эти ферменты (лизины) работают ничуть не хуже, если действовать ими на бактерию снаружи. “Стоит им только соприкоснуться с бактерией, и она погибнет”, – говорит он. Более того, большинство лизииов, выделенных Фискетти, оказались веществами такого же прицельного действия, как и сами производящие их фаги. К настоящему времени ему удалось выделить лизины, эффективные против возбудителя сибирской язвы и полудюжины болезнетворных разновидностей стрептококков. Кроме того, Фискетти показал, что эти вещества работают не только в пробирке: например, они позволяют вылечивать мышей от пневмококков – главных возбудителей ушных инфекций и бактериальной пневмонии у людей. “Возможность вылечивать детей и пожилых людей от пневмококков уже позволит спасти множество жизней и предотвратить развитие множества воспалений среднего уха”, – говорит он. Но важнее всего, наверное, то, что выделенные Фискетти пневмококковые лизины не трогают “хороших” стрептококков, таких как Streptococcus salivarius и S. vestibularis, помогающих выгонять из организма их более опасных родственников.

Использование лизинов бактериофагов вместо целых вирусов позволяет также избежать опасностей, связанных с обменом генами и иммунными реакциями. При этом иммунная система не пытается очистить организм от лизинов с их маленькими молекулами, и они могут долгое время сохраняться в тканях, подобно традиционным антибиотикам. По словам Фискетти, за те лет десять, что он работает с лизинами, ему редко доводилось сталкиваться с выработкой устойчивости к ним у бактерий. “Мы всеми силами пытались стимулировать ее выработку”, – говорит он и описывает эксперименты, в которых бактерий подвергали воздействию низких концентраций препарата, а затем искали обладателей частичной устойчивости среди выживших. “Но бактерий никогда нельзя недооценивать, – предупреждает он. – Может быть, устойчивость к лизинам им и сложнее выработать, чем устойчивость к традиционным антибиотикам. Но рано или поздно это случится”.

Что же до того, дождемся ли мы появления лизиновых антибиотиков, Фискетти надеется, что уже нашел необходимые источники финансирования, чтобы в ближайшие несколько лет начать испытания таких средств на людях. Ему помогает то, что у него уже имеется больше двадцати патентов на различные вещества, в том числе необычайно широкий патент на использование любых фаговых лизинов для профилактики инфекций путем очищения кожи, слизистых оболочек или кишечника человека от микробов, склонных вызывать неприятности.

Наиболее перспективным направлением использования целых фагов, предсказывает Фискетти, станет применение их для уничтожения устойчивых к антибиотикам бактерий вне организмов, например в больницах и в домах престарелых. Исследователи из компании Intralytix в настоящее время разрабатывают как раз такое содержащее фагов средство для дезинфекции, действующее специфически на листерий. Этот аэрозоль, по словам Сулаквелидзе, идеально подойдет для использования на предприятиях пищевой промышленности, особенно для обеззараживания таких известных мест скопления бактерий, как системы кондиционирования воздуха и водостоки. “Даже высокие концентрации химикатов нередко не позволяют уничтожить всех бактерий в таких местах, – объясняет он. – Листерии плодятся там вновь и вновь”. В таких ситуациях целые фаги могут иметь преимущество перед их лизинами, потому что сами вирусы способны сохраняться там и размножаться, пока им есть кого заражать.

Компания Intralytix уже получила официальное разрешение на тестирование одного из дезинфицирующих средств, разработанных ее сотрудниками, на птицефабриках и начала сотрудничество с исследовательской службой Министерства сельского хозяйства США для тестирования фаговых аэрозолей и жидкостей на зараженных листериями и сальмонеллами продуктах, хотя полученные результаты оказались неоднозначными. Другие исследовательские группы пытались применять фагов для снижения уровня бактериального загрязнения мяса. Особенно успешно такие испытания прошли фаговые аэрозоли, распыляемые на поверхность сырой говядины, свинины и мяса птицы. Не столь успешными оказались опыты по добавлению фагов в корм животных непосредственно перед забоем.