Новое окно в мир микробов

Методы выращивания анаэробных культур, разработанные Холдеман и Муром, наряду с использованными Гордоном способами “генетического подслушивания” сделали микрофлору толстой кишки самой изученной из множества микробных экосистем нашего организма. Но по меньшей мере 10% видов бактерий, постоянно обитающих у нас в кишечном тракте, никто еще не выращивал в культуре и не описывал. В первые годы XXI века появилась новая революционная технология, которая дала науке возможность далеко продвинуться в поисках последних из них – самых загадочных обитателей нашего организма. Попутно она сильно озадачила мир медицины, обнаружив бактерий в таких частях нашего организма, в которых, как считалось, микробы могут оказаться только при серьезном расстройстве.

Эта технология – генное зондирование – появилась благодаря трудам микробиолога Карла Вёзе, работающего в Иллинойсском университете. В семидесятых и восьмидесятых годах Вёзе занимался поисками генетического мерила для определения степеней родства между разными группами бактерий нашей планеты. Ученые уже давно искали лучший способ объединять организмы в систематические группы, чем по внешним признакам, таким как внешний вид и особенности деятельности (эта тактика могла, например, приводить к попаданию в одну группу микробных аналогов бабочек и летучих мышей). Вёзе понял, что, поскольку все гены со временем накапливают не имеющие никаких последствий крошечные изменения, ему нужен был ген, который был бы одновременно жизненно необходимым всем живым клеткам и достаточно сложным, чтобы небольшие изменения в последовательности его ДНК‑букв можно было использовать для измерения эволюционного расстояния. В качестве такого мерила Вёзе выбрал ген, кодирующий одну из ключевых частей бактериальной рибосомы – белковой фабрики бактериальной клетки. Это позволило ему открыть совершенно неожиданное разветвление древа жизни – древнее расхождение, в результате которого возникла отдельная ветвь похожих на бактерий микроорганизмов, которых он назвал археями. Как оказалось, генетически отличные от настоящих бактерий археи живут преимущественно в экстремальных условиях, таких как глубоководные “черные курильщики” и горячие серные источники, но среди них нашлось и несколько обитателей человеческого организма, таких как метаногенные Methanobrevibacter”.

Пока Вёзе перерисовывал древо жизни, один из его постдоков, Норман Пейс, понял, что подобный ключевой ген можно применить также в чем‑то вроде ДНК‑дактилоскопии, чтобы выявлять множество бактерий в образцах населенной ими среды, например почвы или воды. Иными словами, можно было сделать ДНК‑зонд, который позволил бы искать рибосомные гены бактерий в почве или воде, используя в качестве мишени участок одного и того же гена, имеющегося у всех бактерий. Извлекая эти отрезки ДНК из образца, можно было затем изготовить тысячи копий подобных участков с помощью ПЦР, или полимеразной цепной реакции, – той самой методики амплификации (увеличения числа копий) генов, которую используют судмедэксперты для амплификации генетических “отпечатков пальцев”, оставленных на месте преступления. После этого можно было рассортировать эти фрагменты на основании небольших различий между ними. Красота нового метода состояла в том, что он позволил Пейсу выявлять бактерий в смешанном образце, используя ДНК‑буквы единственного гена в качестве “штрих‑кода”, – что намного проще, чем выделять и выращивать представителей каждого вида в культуре, впоследствии определяя их по химическим и визуальным отличительным признакам.

К концу восьмидесятых микробиологи всего мира с энтузиазмом взяли на вооружение изобретенный Пейсом метод. При этом они остановились на одном рибосомном гене (кодирующем одну из частей рибосомы – так называемую 165 рРНК), чтобы использовать его в генетической дактилоскопии бактерий. Вскоре секвенирование этого гена у каждой исследуемой бактерии стало общей практикой. В результате этих исследований была создана постоянно растущая библиотека вариантов гена 165 рРНК, которую можно было использовать для определения бактерий тем же способом, каким судебно‑медицинские эксперты сравнивают обнаруженную на месте преступления ДНК с ДНК известных преступников.

Но, быть может, еще важнее было то, что зондирование с использованием гена 165 рРНК впервые дало микробиологам способ, позволяющий напрямую выявлять бактерий, которых нельзя выращивать в чистой культуре, то есть отдельно от сбивающей с толку мешанины из других микробов, вместе образующих единые природные сообщества. Если же какой‑либо “отпечаток” гена 165 рРНК отсутствует во всех библиотеках известных микроорганизмов, значит – эврика! – вы открыли новый вид. Более того, этот новый вид можно поместить в определенную систематическую группу, возможно – даже в какой‑либо из уже описанных родов, сравнивая его с хорошо известными видами в поисках наиболее похожего.

Генные зонды Пейса открыли микробиологам новое окно в мир микробов. Например, в 1986 году Пейс опубликовал данные о том, что ранее неизвестные и не выращивавшиеся в культуре бактерии составили, как ни сложно в это поверить, 99 % всех бактерий в некоторых из исследованных им образцов почвы, грязи и воды. Не могло оказаться, что это относится и к сложным микробным сообществам, населяющим человеческий организм?

В числе первых исследователей, занявшихся поискам генов 165 рРНК в человеческих тканях, были микробиологи Дэвид Релман из Стэнфордского университета и Кен Уилсон из Университета Дьюка. В1991 году независимо друг от друга они оба занялись зондированием тканей пациентов, зараженных ВИЧ и страдающих болезнью Уиппла. Симптомы этой болезни, редко встречающейся у людей со здоровой иммунной системой, включают сильную потерю веса, артрит и повреждения различных органов. В течение восьмидесяти пяти лет медикам не удавалось культивировать маленький палочковидный организм, который попадался им в тканях пациентов, и поэтому у них не было возможности ни определить его, ни сравнить с другими, известными разновидностями бактерий. Проведенное Уилсоном и Релманом секвенирование гена 165 рРНК этого загадочного микроба позволило уверенно отнести его к порядку актиномицетов (Actinomycetales) – бактерий, образующих ветвящиеся нити, напоминающие гифы грибов (к этому порядку относятся многие представители микрофлоры ротовой полости и кишечника). Еще важнее было то, что Уилсон и Релман дали медикам новый метод генетического анализа, позволяющий быстро диагностировать болезнь Уиппла, что было жизненно важно, потому что своевременное лечение соответствующим антибиотиком позволяет останавливать развитие этой инфекции раньше, чем она вызовет необратимые нарушения в сердце и головном мозге.

Еще через пару лет Релман продолжил поиски гена 165 рРНК, на этот раз в ротовой полости здорового человека (своей собственной), с единственной целью – оценить уровень разнообразия ее экосистемы. Он вернулся в лабораторию от зубного врача с несколькими заранее стерилизованными пробирками, в которых находились соскобы, взятые с его зубов непосредственно из‑под края десен. Затем вместе с сотрудниками своей лаборатории он амплифицировал бактериальную ДНК из этих образцов и секвенировал 264 различных варианта гена 16S рРНК. qyrb больше половины соответствовали вариантам этого гена, отмеченным у известных бактерий, а тридцать пять оказались отличными настолько, что указывали на новые для науки виды (а не штаммы, то есть разновидности, уже известных видов).

Начиная с 1994 года Брюс Пейстер и Флойд Дьюхёрст из Института Форсайта, филиала Гарварда, проводят генное зондирование на ген 165 рРНК для намного более полного анализа микробиоты ротовой полости, оценивая уровень разнообразия микроорганизмов у десятков испытуемых, как здоровых, так и страдающих от различных стоматологических проблем. К настоящему времени им удалось обнаружить варианты этого гена у представителей семисот с лишним разновидностей бактерий ротовой полости, большинство из которых были ранее неизвестны. Во рту одного человека, по данным Пейстера и Дьюхёрста, их обычно одна или две сотни. Некоторые из этих бактерий всегда связаны с расстройствами, в то время как другие способствуют свежему дыханию и поддерживают здоровье ротовой полости.

Ученые из Института Форсайта создали на основе своей обширной базы данных по гену 165 рРНК специальный ДНК‑ микрочип, который можно использовать как своего рода устройство для считывания штрих‑кода, чтобы быстро определять, какие именно из двух сотен преобладающих разновидностей бактерий ротовой полости имеются у человека во рту и присутствуют ли они в большом или в малом количестве. Этот микрочип, хотя он еще и не готов к внедрению в стоматологическую практику, позволяет исследователям оценивать риск развития стоматологических заболеваний, выясняя, кого из “хороших парней” не хватает, а также кто из нарушителей порядка проник в ротовую полость. Он также позволяет им отслеживать, что происходит со сложными комплексами бактерий во рту пациента по ходу лечения, будь то обработка корневого канала или курс антибиотиков (то и другое иногда оказывается источником новых неприятностей).

ДНК‑микрочипы позволили микробиологам отслеживать подобным образом изменения, происходящие и в других экологических нишах нашего организма. Например, в 2006 году Релман и Гордон вместе с учеными из Института геномных исследований в Роквилле (штат Мэриленд) завершили амбициозный проект по секвенированию гена 165 рРНК обитателей кишечного тракта. Они обнаружили в образцах стула двух здоровых взрослых людей больше двух тысяч различных вариантов этого гена, из которых около ста пятидесяти отличаются настолько, что соответствуют новым разновидностям бактерий, а тридцать пять – новым для науки видам.

Тем временем Релман и его коллеги продолжают находить бактерий в тканях, которые долго считались безмикробными. “Может выясниться, что в человеческом организме не так уж много тканей, в которых нельзя обнаружить присутствие бактериальной ДНК”, – говорит Релман. Представляют ли эти микробы скрытые инфекции или нормальную микрофлору – это еще предстоит выяснить. “На что я надеюсь, – говорит он, – так это на то, что, начав с образцов, взятых у здоровых людей, мы будем вправе предполагать, что обнаруженные у них микробы, вероятно, были с нами на протяжении какой‑то части нашего пребывания на этой планете и вполне могут оказаться важными для нашего здоровья”.