Культура каллусных клеток

Основным типом культивируемых растительных клеток является каллусная, значительно реже культивируют клетки опухолевых тканей растений. Культуры опухолевых клеток при глубинном и поверхностном выращивании внешне и по морфологии клеток мало отличаются от культур каллусных клеток. Главным отличием опухолевых клеток является их гормональная независимость, что обеспечивает им рост на питательных средах без добавок фитогормонов или их аналогов. Кроме того, опухолевые клетки лишены способности давать начало организованным структурам, таким, как корни или побеги в процессе органогенеза. Каллусные клетки в культуре могут спонтанно приобретать гормононезависимость, природа которой может быть следствием мутации или результатом экспрессии генов, определяющих независимость клетки от гормонов.

Каллусная клетка, при делении которой возникает каллусная ткань или каллус, представляет один из типов клеточной дифференциации свойственной высшему растению. В исключительных ситуациях у нормального растения может возникать каллусная ткань (обычно это случается при травмах), которая функционирует непродолжительное время, защищая растение в участке повреждения и накапливая питательные вещества для регенерационного процесса.

Для получения культивируемых каллусных клеток кусочки (фрагменты) тканей различных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду в пробирках, колбах или чашках Петри, строго соблюдая правила стерильности.

Основными компонентами питательных сред для культуры тканей и клеток растений являются минеральные соли (макро- и микроэлементы), источник углерода (обычно сахароза или глюкоза), витамины и регуляторы роста. Иногда возникает необходимость добавления в среду различных комплексных соединений (таких, как гидролизат казеина, смесь аминокислот, дрожжевой экстракт, различного рода растительные экстракты и т. п.). Как правило, при работе с новым объектом приходится эмпирическим путем подбирать оптимальные составы используемых питательных сред.

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу, не имеющую определенной анатомической структуры, цвет которой может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. По консистенции каллусные ткани также могут существенно различаться.

Химический состав каллусной ткани и ткани органа, из которого она получена, как правило, различается. Каллусные ткани, выращиваемые поверхностным способом, часто применяются для поддержания в растущем состоянии коллекций различных штаммов, линий, мутантов; из них получают суспензии клеток для культивирования в жидкой питательной среде, а также для регенерации растений.

Культивирование клеток растений в жидкой среде имеет ряд преимуществ перед выращиванием поверхностным способом каллусных культур. В условиях жидкого культивирования значительно легче влиять на метаболизм и рост клеточных популяций различного рода экзогенными факторами. Суспензионные культуры намного удобнее для биохимических и молекулярно-биологических экспериментов – изучения индукции ферментов, процессов экспрессии генов, изолирования и характеристик получаемых мутантов и т. п.

Для глубинного культивирования (суспензионные культуры) растительных клеток применяют приемы, используемые в микробиологии. Это и выращивание в замкнутых или открытых системах, при периодическом или непрерывном режимах, однако наиболее изученным и наиболее распространенным способом глубинного культивирования суспензии растительных клеток пока еще остается закрытая периодическая система с использованием ферменторов с механическими мешалками или с аэрацией восходящими воздушными потоками. При указанном способе выращивания рост клеточной популяции характеризуется показателями, довольно близко напоминающими таковые при аналогичном культивировании микробных клеток, т. е. выделяют фазу задержанного роста (лаг-фазу), экспоненциальную фазу, фазу замедленного роста, стационарную и фазу отмирания или деградации клеток. Продолжительность фаз зависит от ряда факторов, связанных как с особенностями выращиваемых В культурах клеток обнаруживаются традиционные для растений вещества, а также необычные соединения: алкалоиды, гликозиды, полисахариды, эфирные масла, пигменты и пр. Использование растительных клеток для производства ферментных препаратов позволяет получать разнообразные ценные продукты из натуральных или синтетических предшественников. Однако медленный рост, длительное поддержание стерильных условий, чувствительность к механическим повреждениям и ряд других менее существенных недостатков ограничивают применение суспензионных культур растительных клеток в промышленных масштабах. Кроме того, во многих случаях содержание требуемого продукта в суспензионных культурах клеток растений довольно низкое, что также предстоит преодолеть биотехнологам, занимающимся культивированием данных объектов.

Для клональной селекции мутантных, гибридных или трансформированных клеток используются методы выращивания изолированных (отдельных) клеток, которые получаются путем выделения их из суспензий с помощью микроманипуляторов либо посредством разведении, а также из регенерированных протопластов.