ДНК-маркеры на основе ПЦР с праймерами, имеющими множественную локализацию в геноме
Особый класс ДНК-маркеров основан на использовании праймеров, имеющих множественную локализацию в геноме. Это может быть достигнуто при использовании одного короткого праймера с произвольной последовательностью (RAPD - Randomly amplified polymorphic DNA и ее аналогов), при использовании праймеров с искусственно добавленными последовательностями (адаптерами) (AFLP - Amplified fragment length polymorphism) или праймеров, комплементарных к повторяющимся элементам генома, таким как микросателлиты (ISSR - Inter-simple-sequence-repeats) или транспозоны (IRAP - Inter-retransposon amplified polymorphism).
RAPD-маркеры. К этой группе относятся маркеры, основанные на ПЦР с применением праймеров с произвольной, случайной последовательностью. Для синтеза таких праймеров нет необходимости в знании конкретных нуклеотидных последовательностей генома исследуемого организма. Праймеры с произвольной последовательностью должны лишь отвечать определённым требованиям по соотношению GC-пар (около 60%) и длине. Этот метод был предложен независимо двумя группами исследователей и получил название RAPD (Random Amplified Polymophic DNA) или AP-PCR (Arbitrarily Primed PCR). Суть метода заключается в амплификации фрагментов ДНК с использованием единичного короткого праймера с низкой температурой отжига в реакции ПЦР. Праймер связывается с геномной ДНК в двух различных участках инвертированных повторов. При электрофоретическом разделении амплифицированных продуктов образуются дискретные продукты, размер которых варьирует от 100 до 5000 п.н. (ДНК-паттерны). Эти фрагменты представляют собой анонимную, как правило, уникальную последовательность ДНК, заключенную между двумя инвертированными повторами. Различия в ДНК-паттернах определяются различиями в одном или обоих праймер-связывающих сайтах (наличие или отсутствие полосы ПЦР-продукта в спектре) или присутствием инсерции/делеции в амплифицируемом фрагменте (различия ПЦР-продуктов по размеру). Большинство RAPD-маркеров являются доминантными (наличие/отсутствие полосы в ДНК-паттерне).
Несколько позже были предложены другие сходные технологии: DAF (DNA Amplified Fingerprinting) и УП ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами). Все описанные методики различаются размерами праймеров (10-12 нуклеотидов в случае RAPD, около 20 нуклеотидов в случае AP-PCR, 7-8 нуклеотидов в случае DAF и 25-27 нуклеотидов в случае УП-ПЦР), их составом (от 50 до 80% ГЦ-пар), температурой отжига и методами выявления продуктов реакции (окрашивание бромистым этидием, радиоавтография, серебрение).
RAPD-анализ может служить своеобразным экспресс-методом выявления генетического полиморфизма, что особенно актуально для малоизученных таксономических групп. Диагностические возможности RAPD-технологии успешно проиллюстрированы на многочисленных примерах описания генетического разнообразия микроорганизмов, высших растений, беспозвоночных и позвоночных животных. RAPD применяется также для геномного маркирования в популяционных и эволюционных исследованиях. Например, для разных видов грибов с помощью УП-ПЦР показана видоспецифичность ДНК-паттернов. Наиболее подробно с помощью RAPD-PCR изучались культурные растения, cельскохозяйственные и лабораторные животные с целью идентификации и дифференциации пород и отдельных линий, картирования хромосом и маркирования хозяйственно-ценных признаков. Показаны ассоциации некоторых RAPD-маркеров с генами резистентности к различным болезням у растений.
К недостаткам метода следует отнести низкую воспроизводимость результатов, обусловленную повышенной чувствительностью к условиям реакции: концентрации ионов магния, соотношению праймер/матрица, температурному режиму. Тем не менее RAPD-анализ может быть использован как экспресс-метод выявления генетического полиморфизма и как источник уникальных локус-специфичных маркеров.
Для получения локус-специфичных маркеров интересующий исследователя фрагмент экстрагируют из геля, клонируют и секвенируют. На основе полученного сиквенса подбирают праймеры, которые амплифицируют единичный фрагмент с высокой степенью воспроизводимости. Полученные таким способом вторичные маркеры названы SCAR-маркерами (Sequence Characterized Amplified Region). Многие из них кодоминантны и могут быть использованы как уникальные маркеры в различных областях исследований. Полиморфизм SCAR-маркеров может быть увеличен путем рестрикционного анализа ПЦР-продукта.
Полиморфизм длин продуктов амплификации (AFLP-маркеры)
Для исследования вариабельности генома в целом может быть также использован метод анализа AFLP. Этот метод также не требует ни предварительного клонирования, ни секвенирования ДНК. Особености этого подхода заключаются в использовании в качестве матрицы рестрицированных фрагментов ДНК, лигированных со специфическими олигонуклеотидными адаптерами, и проведении избирательной амплификации со специально сконструированными праймерами. Праймеры состоят из фиксированной части, содержащей последовательность, комплементарную адаптеру и сайту рестрикции использованной эндонуклеазы (~ 15 нуклеотидов), и короткого фрагмента (на 3'-конце) с произвольной последовательностью нуклеотидов (2-4 нуклеотида). Фиксированная часть придает праймеру стабильность и, в результате, хорошую воспроизводимость метода, а короткая последовательность со случайным набором нуклеотидов позволяет определять и контролировать пропорцию лигированных фрагментов, которые могут быть амплифицированы. С каждой парой праймеров амплифицируется 75-100 фрагментов (AFLP-финргерпринтинг), которые разделяют в агарозном или полиакриламидном геле. Поскольку каждый фрагмент представляет собой уникальный сайт, количество локусов, анализируемых одновременно с каждой комбинацией праймеров, гораздо больше, чем при любой другой технике анализа полиморфизма ДНК. С одного геля обычно удается получить до 40 полиморфных локусов. Этот тип полиморфизма ДНК также имеет доминантный тип наследования. AFLP-маркеры часто наследуются как тесно сцепленные кластеры в районе центромеры или теломеры хромосом, но наблюдается и случайное распределение маркеров вне этих кластеров, что позволяет, используя этот подход, быстро генерировать сотни высоковоспроизводимых маркеров. AFLP-маркеры были успешно использованы для геномного картирования, в популяционных и филогенетических исследованиях. В последние годы эти маркеры получают все более широкое распространение для исследования мало изученных таксономических групп.
ISSR. Для создания ISSR-маркеров используют праймеры, комплементарные микросателлитным повторам (4-12 единицам повтора) и несущие на одном из концов последовательность из двух-четырех произвольных нуклеотидов (так называемый "якорь"). Такие праймеры позволяют амплифицировать фрагменты ДНК, которые находятся между двумя достаточно близко расположенными микросателлитными последовательностями (как правило, это уникальная ДНК). В результате амплифицируется большое число фрагментов, представленных на электрофореграмме дискретными полосами (ISSR-фингерпринтинг). Полученные паттерны ПЦР-продуктов видоспецифичны. ISSR-маркеры также относятся к маркерам доминантного типа наследования, полиморфизм которых тестируется по наличию/отсутствию полосы. Аналогично RAPD и AFLP для создания ISSR-маркеров не требуется предварительного знания нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК. Метод обладает хорошей воспроизводимостью и наряду с AFLP может быть с успехом использован для выявления межвидовой и внутривидовой генетической изменчивости, идентификации видов, популяций, линий, а в ряде случаев и для индивидуального генотипирования. ISSR-маркеры могут быть использованы также для картирования геномов и маркирования хозяйственно-полезных признаков.
Микросателлиты
Микросателлиты - первые, полученные с использованием ПЦР, высокополиморфные маркеры для индивидуальных локусов. Подобно минисателлитам, микросателлиты относятся к диспергированным тандемно повторяющимся последовательностям, но единицы повторов (ди-, три- и тетрануклеотиды) и общий размер повторяющейся области существенно короче (как правило, не более 100 п.н.). Эти маркеры известны под несколькими названиями: микросателлиты, STMS (Sequence Tagged Microsattelite Site), STR (short tandem repeat), SSR (simple sequence repeat). По аналогии с системой STS была предложена система STMS, которая фактически является частью системы STS. Для создания STR подбираются праймеры к уникальным последовательностям ДНК, фланкирующим микросателлитный повтор, что требует предварительного знания их нуклеотидной последовательности. Полиморфизм STR определяется различной копийностью мономерных единиц в кластере, что приводит к существованию множественных аллельных вариантов. Гетерозиготность их очень высока (часто более 75%). При создании новых полиморфных маркеров, кроме динуклеотидов, используются микросателлиты три- и тетрамерных мотивов, значительная часть которых также высокогетерозиготна. Благодаря большей длине звена, применение тримеров и тетрамеров позволяет упростить методику анализа аллельного полиморфизма.
Микросателлиты широко распространены в эукариотических геномах (как растительных, так и животных). Например, в геноме человека динуклеотидные повторы встречаются в среднем каждые 2 т.п.н.
Согласно общепринятой точке зрения, полиморфизм микросателлитов обусловлен ошибками (эффект "проскальзывания") в процессе репликации или репарации ДНК. Средний темп мутирования динуклеотидных повторов оценивают примерно в 6,9х10-4, хотя эти оценки могут существенно различаться.
Высокий уровень полиморфизма микросателлитов, относительно равномерное их распределение в эухроматиновой части геномов и широкая представленность сделали их чрезвычайно популярными. Применение их при картировании генома человека позволило совместить физические и генетические карты хромосом. Гипервариабельные микросателлиты представляют собой универсальную систему генетических маркеров для анализа наследуемых изменений на уровне ядерной ДНК и широко используются в исследованиях генетического полиморфизма популяций человека, растений и животных.
Несмотря на высокую популярность микросателлитов, они имеют и некоторые недостатки. Неравномерность скорости мутирования разных микросателлитов создает определенные сложности для популяционно-генетического анализа. Имеются и технические проблемы, такие как артефакты при проведении ПЦР (за счет эффекта "проскальзывания"), сложности в разработке технологий для автоматического скрининга микросателлитных аллелей. Кроме того, несмотря на высокую плотность микросателлитных локусов в геноме, их бывает недостаточно для тонкого картирования отдельных областей геномов, создания маркеров для локусов количественных признаков (QTL) и решения многих других задач.
Полиморфные маркеры, основанные на тестировании однонуклеотидных замен (SNPs)
Согласно общепринятому определению SNPs (от англ. Single Nucleotide Polymorphism) - это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей (аллели) с частотой редкого аллеля не менее 1%. В базы данных SNPs обычно включают все небольшие изменения геномных последовательностей (небольшие инсерции/делеции (так называемые "intels"), изменения нескольких нуклеотидов), хотя они и не входят в формальное определение SNPs. Обычно SNPs представлены двумя аллельными вариантами, хотя встречаются и трехаллельные SNPs (например, в геноме человека их около 0,1% от всех SNPs).
SNPs не являются совершенно новым типом ДНК-маркеров. Самые первые ДНК-маркеры (ПДРФ-маркеры) также относятся к этому типу. Однако введение этого термина позволило объединить под общим названием все маркеры, обусловленные одиночными нуклеотидными заменами в последовательности ДНК, независимо от способа их тестирования.
SNPs чрезвычайно широко распространены не только в геноме человека, но и в геномах других организмов. Предполагается, что у человека точковые замены наблюдаются один раз на 1000 нуклеотидов. В настоящее время в базах данных по нуклеотидным последовательностям человека представлены около 6 млн. SNPs. Огромное количество SNPs в геноме человека позволяет отобрать порядка 100000 так называемых "распространенных" (с частотой редкого аллеля более 20%) SNP-маркеров, при среднем расстоянии между маркерами 30 т.п.н. Никакой другой тип геномных различий не способен обеспечить такую плотность маркеров. Помимо высокой плотности, SNPs имеют низкий уровень мутаций на поколение (~10-8), что делает их удобными маркерами молекулярной эволюции при оценке крупномасштабных эволюционных событий.
Основным достоинством SNPs является возможность использования автоматических методов их детекции, например, использование ДНК-микропанелей (microarrays). Существующие способы тестирования SNPs можно условно разделить на несколько групп,. Разделение условно, поскольку в большинстве случаев используются сочетания различных подходов. Подробно с методами типирования SNPs можно ознакомиться в обзоре, представленном на сайте Здесь мы рассмотрим лишь некоторые, наиболее распространенные методы.
ПЦР-ПДРФ. Этот метод относится к ферментативным методам анализа SNPs и аналогичен методу ПДРФ, но в его основе лежит использование ПЦР. Рестрикции (одной или несколькими рестриктазами) в этом случае подвергаются продукты амплификации, а не геномная ДНК. Благодаря простоте и надежности метод получил широкое распространение и до сих пор используется для анализа аллельного полиморфизма генов у самых разных объектов. Ограничением метода является то, что с его помощью можно тестировать только известные мутации, затрагивающие сайты рестрикции. В зарубежных публикациях широко используется термин CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) - рестрикционный полиморфизм амплифицированных последовательностей. CAPS-маркеры считаются вторичными маркерами, так как праймеры для них создаются после выявления SNP на основе анализа нуклеотидной последовательности.
Аллель-специфичная ПЦР. Аллельные варианты различаются за счет того, что 3'-концевой нуклеотид одного из праймеров гибридизуется непосредственно с вариабельным нуклеотидом (позиция SNP), что обуславливает наличие или отсутствие ПЦР. Специфичность реакции можно повысить, вводя дополнительный, не спаренный нуклеотид во второй или третьей позиции с 3'-конца этого же праймера или используя конкурирующую ПЦР в той же пробирке. Аллель-специфичная ПЦР широко используется для типирования отдельных аллелей генов, или групп аллелей, несущих одинаковые мотивы, например, для типирования аллелей, определяющих устойчивость или восприимчивость крупного рогатого скота к лейкозу.
ПЦР с терминацией синтеза. Существует несколько вариантов этого подхода. В одном из них ПЦР проводится по стандартной схеме, но один из дезоксинуклеозидтрифосфатов берется в лимитирующей реакцию концентрации. Это приводит к тому, что после нескольких циклов синтез ДНК обрывается в позициях, соответствующих лимитирующему нуклеотиду. Реакция напоминает секвенирование. Метод прост в исполнении, но для детекции SNP не очень удобен, т.к. требует подбора условий ПЦР для каждого локуса.
Однонитевой конформационный полиморфизм ДНК (SSCP, Single Strand Conformation Polymorphism) в особенности эффективен для поиска новых однонуклеотидных замен в ДНК. Метод SSCP заключается в следующем: после проведения PCR продукт амплификации денатурируют и полученные однонитевые молекулы разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Любая нуклеотидная замена в исследуемой последовательности приводит к изменению заряда однонитевого фрагмента, а следовательно, и его электрофоретической подвижности и может быть тестирована в качестве полиморфного варианта. Этот подход позволяет выявлять нуклеотидные замены, делеции, инсерции на протяжении всей длины амплифицированного продукта, а не только в местах узнавания рестриктаз, что делает этот подход более информативным. Простота метода, умеренная стоимость и возможность использования флуоресцентной метки и капиллярного электрофореза (ABI Prism 310) позволяет легко автоматизировать процесс и анализировать одновременно большое количество локусов.
Для типирования однонуклеотидных замен в ПЦР-продуктах могут быть использованы методы электрофореза в денатурирующих гелях с постоянной концентрацией денатурирующего агента (CGGE - constant gradient gel electrophoresis), с градиентом денатурирующего агента (денатурирующий градиентный гель-электрофорез, DGGE - denaturating gradient gel electrophoresis), или с использованием градиента температуры (TGGE - temperature gradient gel electrophoresis). Методы разделения основаны на различиях в температуре плавления фрагментов ДНК с разной нуклеотидной последовательностью. Содержащий мутацию фрагмент обнаруживается по изменённой электрофоретической подвижности. В качестве денатурирующих агентов используют чаще всего формамид или мочевину.
Анализ гетеродуплексов. В этом случае денатурированные контрольный и анализируемый ПЦР-продукты не разделяют в геле, а сначала позволяют им ренатурировать. Одноцепочечные фрагменты образуют гомодуплексы, если последовательности двух цепей полностью комплементарны, или гетеродуплексы, если они отличаются хотя бы на один нуклеотид. Гомо- и гетеродуплексы имеют разную электрофоретическую подвижность, что используется для их разделения.
Для тестирования гетеродуплексов могут быть использованы химические методы их расщепления, обеспечивающие практически 100%-ное узнавание всех типов гетеродуплексов, что недоступно при использовании современных ферментативных подходов. К недостаткам метода следует отнести сложность процедуры и токсичность используемых реагентов.
Детекция на твёрдых подложках (микропанелях, англ. microarrays). Микропанель - это твердый носитель небольшого размера (например, стекло, нейлон или металлическая пластинка) с прикрепленными к нему в определенном порядке короткими олигонуклеотидами или фрагментами ДНК. Прикрепление одного из компонентов реакции к подложке позволяет проводить параллельно множество реакций, пространственно разделив детекцию отдельных SNPs. Микропанели могут применяться как для скрининга мутаций, так и для детекции известных аллелей. О наличии/отсутствии мутации судят по уровню гибридизационного сигнала тестируемой ДНК с иммобилизованными на матрице фрагментами.
В случае поиска еще неизвестных SNP на матрице иммобилизуются олигонуклеотиды, содержащие в каждой позиции любой из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (VDA, variant detector array). Олигонуклеотид, полностью комплементарный флуресцентно-меченому зонду, даст более сильный сигнал, чем отличающиеся от него в одной из позиций. Скринирование уже известных SNPs значительно упрощается, так как в каждом случае нужны только те олигонуклеотиды, которые соответствуют известным аллельным вариантам. Такие аллель-специфичные наборы олигонуклеотидов были использованы для генотипирования SNPs в различных генах человека. Дальнейшее усовершенствование метода идет в сторону увеличения количества и плотности расположения олигонуклеотидов на носителе, а также повышения чувствительности и специфичности гибридизации.
Физические методы детекции SNP. Альтернативой существующим методам детекции полиморфных участков ДНК является масс-спектрометрическое дифференциальное секвенирование. Время, затрачиваемое на анализ каждого образца этим методом составляет всего несколько секунд. Метод очень чувствителен, позволяет дифференцировать гомо- и гетерозиготы и оценивать долю SNP при одновременном анализе нескольких образцов. Существуют и другие методы детекции SNPs, использующие современные технологии. Все они обладают большими достоинствами, но требуют специального дорогостоящего оборудования.
Секвенирование. Самый точный метод детекции SNP, несомненно, прямое секвенирование интересующего участка генома. Но это дорогой и трудоемкий метод при массовом анализе образцов. Предложено несколько модификаций реакции, снижающих её стоимость, например, секвенирование обеих цепей в одной реакции с использованием двух различно меченых праймеров, совмещение ПЦР и секвенирования в одной пробирке сразу для нескольких локусов и другие.
Дата добавления: 2015-12-16; просмотров: 3310;