ДӘРІС № 8. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ АҚПАРАТТЫҚ ӘДІСТЕР.

Адамның өзіндік тұқымқуалайтын ауруларын генетикалық деңгейде диагностикалау зерттелетін индивидумдар немесе олардың ұрпақтары жоғары генетикалық қауіпті топқа жататыны немесе жатпайтыны туралы сұраққа жауап береді. ДНҚ-анализді тұқымқуалайтын аурулардың генін тасушыларды анықтауда, сонымен қатар қауіпті генетикалық ауытқулардың прентальды және пресимптомды диагностикасын жүргізуде пайдалануға болады.

ДНҚ деңгейінде тестілеу арқылы спецификалық мутацияларды қатесіз анықтауға болады. Бұрын бұл үшін зерттелетін ген өнімін анықтауға негізделген биохимиялық әдістер қолданылған. ДНҚ-тесттер мутантты геннің экспрессиясын жүргізуді қажет етпейді, бұл барлық моногенді ауруларға арналған скрининг жүйесін ойлап табуға мүмкіндік жасайды.

Орақ тәрізді клеткалы анемия

Орақ тәрізді клеткалы анемия – кодондағы гемоглобин молекуласының -тізбегіндегі алтыншы амин қышқылына сәйкес келетін нуклеотидтің біреуінің алмасуымен сипатталатын генетикалық ауру. Мутантты гені (S/S) гомозиготалы науқастарда эритроциттері ерекше орақ тәріздес пішінге ие; бұл гемоглобин молекуласында валиннің глутамин қышқылына алмасуы салдарынан конформациясының бұрмалануына байланысты. Мутантты гемоглобин жеткілікті мөлшерде оттегін тасымалдай алмайды, осындай науқастарда жүрек, өкпе, ми, буындар үдемелі түрде зақымдалатын қауіпті анемия дамиды. Берілген гені бойынша гетерозиготалы (A/S) (генетикалық ауруды тасушылар) науқастарда эритроциттер қалыпты (нормальная) пішінге ие және аурудың белгілері тек экстремалды жағдайларда ғана байқалады (аса биік жерлерде немесе организмнің оттегімен қамтылуы төмендеген кездегі тым жоғары немесе төмен температураларда). Егер ата-ананың екеуі де гетерозиготалы болса (генотипі A/S), онда олардың балалары мутантты ген бойынша гомозиготалы (S/S) болу ықтималдығы 25%. Орақ тәрізді клеткалық анемияның гені жоғарғы жиілікпен афроамерикандықтар мен олардың ұрпақтарында, сонымен бірге латиноамерикандықтарда кездеседі. АҚШ-та орақ тәрізді анемия генін өзінің ұрпақтарына бере алатын тасушыларды анықтау мақсатында скрининг жүргізіледі. Осы үшін пайдаланылатын тесттердің біреуін қарастырып көрейік.

Орақ тәрізді анемияға әкелетін -глобинді гендегі бір нуклеотидтің алмасуы рестицирлеуші CvnI. эндонуклеазаға арналған сайттың элиминациясымен сүйемелденеді (сопровождается). Бұл фермент CCTNAGG ретін таниды және ДНҚ молекуласын С және Т негіздері (N – төрт нуклеотидтің кез келгені) арасында ыдыратады. Қалыпты генде бұл рет мынандай түрге CCTGAGG, ал орақ тәрізді анемия генінде – ССТGTGG түріне ие. Берілген аурудың ДНҚ-диагностикасы осы айырмашылыққа негізделеді.

CvnI сайтын фланкирлеуші праймерлерді қолдана отырып, ПЦР көмегімен тестіленетін ДНҚ-ның азғантай мөлшерін амплифицирлейді. Амплифицирленген фрагментті CvnI өңдейді, рестрикция өнімдерін гель-электрофорезбен бөледі және оларды бромды этидимен бояйды. Cvn1-сайты болған жағдайда электрофореграммада спецификалық жолақтардың жинағы пайда болады. Сипатталған әдіс арқылы гибридизация жүргізбей-ақ, зерттелетін заттың генетикалық статусын қиындықсыз және жылдам анықтауға болады.

ПЦР/ЛОЗ әдісі

Ақаулы гендердің пайда болуына әкелетін генетикалық бұзылулардың рестрикция сайтының жоғалуы немесе өзгеруімен барлығы (не все) сүйемелденбейді, сондықтан бір нуклеотидті ауыстырудың (замена) орнына басқаларды да қолданады. Олардың біреуінде ПЦР және олигонуклеотидті зондтардың (ЛОЗ), ПЦР/ЛОЗ дотирлеуіне негізделген әдіс біріккен.

Қалыпты геннің белгілі сайтында (мысалы, 106-шы орында) А-Т жұбы, ал мутантты геннің дәл сондай сайтында G-S жұбы бар делік. 106-шы нуклеотидті фланкирлейтін нуклеотидті реттілікті біле отырып, берілген сайтқа жабысқан және қарама-қарсы тізбектерге комплементарлы екі қысқа (20-нуклеотидті) фрагментті синтездеуге болады. Олигонуклеотидтердің бұл жұптарының негізгі ерекшелігі – біріншісінің З'-ұштық нуклеотиді (Х зонд) 106-шы орында қалыпты ретпен орналасқан негізге комплементарлы, ал екіншісінің 5'-ұштық нуклеотиді (Y зонд) 106-шы нуклеотидке жабысқан нуклеотидке комплементарлы. ДНҚ-нысанмен қалыпты реттілікке ие осы зондтарды жағу (отжиг) кезінде олардың толық гибридизациясы жүреді, ДНҚ-лигазасының реакционды қоспасын қосқан кезде, X және Y зондтары ковалентті тігіледі. Егер бұл зондтар мутантты ДНҚ-мен жағылған болса, онда оған комплементарлы емес X зондының 3'-ұштық нуклеотиді онымен жұп түзе алмайды. Y зонды бұрынғыдай толығымен гибридизацияланғанымен, ДНҚ-лигаза X және Y зондтарын тіге алмайды.

Мутантты 106-шы нуклеотидтің реттілігіне толық сәйкес келетін басқа да олигонуклеотидті зондтарды синтездеуге болады. Зондтардың мұндай жиынында лигирлеу (лигирование) олардың мутантты ДНҚ-нысанымен жағылуы кезінде болады және қалыпты нысанмен жағылуы кезінде болмайды. Осыған орай, ПЦР/ЛОЗ әдісі екі жағдайды ажыратады: зондтарды лигирлеу және лигирлеудің болмауы.

Лигирлеу жүргенін тексеру үшін X зондының 5'-ұшын биотинмен, ал Y зондының З'-ұшын сәйкес антиденемен байланысатын төменмолекулалы қосылыс – дигоксигенинмен белгілейді. Гибридизация мен лигирлеуден кейін гибридизацияланған зондты босату үшін ДНҚ денатурациясын жүргізеді және қоспаны стрептавидинмен қапталған кішірек пластикалық қуысқа ауыстырады. Стрептаввидинмен байланысқан биотинилирленген зондтан басқа барлық материалды жою үшін қуысты жуады. Сосын алдын ала сілтілі фосфатазамен байланысқан дигоксигенинге антиденені енгізеді. Байланыспаған конъюгаттың жойылуы болатын шаюдан кейін түссіз хромогенді субстратты қосады. Ерітіндідегі бояу дигоксигенинмен белгіленген (меченный) зонды бар дигоксигенин антиденемен байланысқанын, яғни зонд биотинмен белгіленген зондпен лигирленгенін білдіреді. Егер бояу болмаса, онда лигирлеу болмағаны.

Екі жұп болғанда кез келген адамның генетикалық деңгейін анықтауға болады. Мысалы, гетерозиготалы тасушылардың ДНҚ-сы зондтардың екі жұбымен де, қалыпты геннің екі көшірмесі бар ДНҚ иелері тек қалыпты сайтқа комплементарлы нуклеотиді бар зондтар жиынымен, екі геннің өзгертілген көшірмелері бар индивидтер ДНҚ-сы тек мутантты сайтты детектирлейтін зондтар жұбымен ғана оң нәтиже береді. Анализге қажетті бастапқы ДНҚ мөлшерін минимизациялау үшін, гибридизация алдында тестіленетін сайтқа ие ДНҚ-нысан бөлігін ПЦР көмегімен амплифицирлейді.

ПЦР/ЛОЗ жылдам, сезімтал және жоғарыспецификалық әдіс болып табылады. Оның барлық деңгейлері күніне 1200-ге дейін тест жүргізуге мүмкіндік беретіндей етіп роботизацияланған.

ПЦР/ЛОЗ-дың біршама қарапайым әдісі болып лигазды тізбекті реакция табылады. Тестіленетін ДНҚ-ны термотұрықты ДНҚ-лигаза қатысында қалған екі индикаторлы зондпен араластырады. Лигирлеуді 65°С-та жүргізеді, сосын пайда болған зонд гибридтері – ДНҚ-нысанның денатурациясы жүруі үшін температураны 94°С-қа дейін көтереді, ДНҚ-нысаны бар бос лигирленбеген индикаторлы ЛОЗ-зондтарын гибридизациялау мақсатында температураны қайта 65°С-қа төмендетеді. Бұл циклды 20 рет қайталайды. Егер индикаторлы ЛОЗ-зондтар ДНҚ-нысанға толық комплементарлы болса, онда лигирлеу әр циклда болады және 20 циклдан кейін электрофорез немесе ELISA көмегімен анықталатындай жеткілікті лигирлеу өнімдері («тігілген» X және Y зондтары) жинақталады. Егер комплементарлық толық болмаса, лигирлеу болмайды және ешқандай өнімдер тіркелмейді.

Флуоресцентті белгіленген ПЦР-праймерлерді қолдану арқылы генотипирлеу

Колориметриялық генотипирлеу әртүрлі флуоресцентті бояғыштармен белгіленген ПЦР-праймерлерді пайдалануға негізделген. Мутантты ДНҚ мен жабайы типті ДНҚ-ны ажырату үшін, ПЦР-ді екі әр түрлі праймерлермен жүргізеді. Олардың бірі (P1) жабайы типті ДНҚ-мен комплементарлы және 5'-ұшында родаминмен (қызыл түс), екіншісі (P3) мутантты ДНҚ-ға комплементарлы және 5'-ұшында флуоресцеинмен (жасыл түс) белгіленген. Екі жағдайда да амплификацияны қарама-қарсы тізбекке комплементарлы, үшінші белгіленбеген праймер (P2) қатысында жүргізеді. ПЦР тек праймер ДНҚ-нысанға толық комплементарлы болған кезде ғана жүре алатындықтан, реакционды қоспада барлық үш праймер болғанда не жабайы типті ДНҚ, не мутантты ДНҚ, не болмаса матрица рөліндегі ДНҚ-нысанға байланысты олардың екеуі де амплифицирленеді. Егер жабайы типті ДНҚ бойынша индивид гомозиготалы болса, онда ПЦР жүргізген соң және артық праймерлерді жойғаннан кейін қызыл түсті флуоресценция байқалады, ал егер мутантты ДНҚ бойынша гомозиготалы болса – жасыл, егер мутантты ДНҚ да, жабайы типті ДНҚ да (яғни индивид гетерозиготалы) болса – сары. Бұл әдісті белгілі нуклеотидті реттілікке ие кез келген гендегі кез келген бірнуклеотидті сайт-нысанға сай автоматизациялауға және бейімдеуге болады.

Бір геннің әр түрлі сайттарындағы мутациялар

Барлық (не все) генетикалық аурулар гендегі бір ғана спецификалық өзгеріске негізделмейді. Көпшілік жағдайларда мутациялар бір геннің түрлі сайттарында жүреді, бірақ олар бір генетикалық ауруға әкеледі. Мысал ретінде -глобиннің белсенділігін жоғалтумен байланысты тұқым қуалайтын ауру – -талассемияны келтіруге болады. Гетерозиготалы тасушыларда бұл жағдайда аздаған анемия байқалады. Мүмкін болатын мутантты сайттардың кем дегенде сегізден бірі гомозиготалы болатын индивидтер тіршілігін сақтау үшін үнемі қан құю мен басқа емдерге мұқтаж. -глобинді геннің сегіз спецификалық сайтындағы кез келген мутация -талассемияға әкелетіндіктен, кем дегенде сегіз әртүрлі тест жүргізу қажет. Қымбат болса да, мұндай диагностика жасауға болады.

Бір геннің әртүрлі сайтында пайда болатын мутациялар скринингі үшін, бір реакция жүргізуге негізделген ПЦР/гибридизация стратегиясы ойлап табылды. Ол үшін белгілі мутацияны тасушы ген-нысан фрагментіне әрқайсысы толық комплементарлы 20-нуклеотидті зондтардың спецификалық жиынын синтездейді. Әр зондтың 3'-ұшына ұзындығы шамамен 400 нуклеотидке тең poly (dT) гомополимері жалғанған, оның көмегімен ДНҚ-зонд найлонды фильтрде алдын ала белгіленген нүктемен байланысады, ал оның қалған бөлігі бос қалады және гибридизацияланады. Мүмкін болатын мутантты сайттардың біреуіне ие тестіленетін ДНҚ сегменттері ПЦР көмегімен бір уақытта амплифицирленеді, әр жұптың бір праймері 5'-ұшында биотиппен белгіленген. ДНҚ-нысанның амплифицирленген фрагменттері тек толық комплементарлы реттіліктердің гибридизациясын қамтамасыз ететін жағдайларда ғана фильтрге тігілген зондтармен гибридизацияланады. Гибридизациялық қоспаға сілтілі фосфатазамен (сонымен қатар хрен пероксидазасы мен уреазаны пайдалануға болады) байланысқан стрептавидин қосады. Гибридизациядан кейін фильтрді жуады және боялмаған субстратты енгізеді. ДНҚ-нысанның амплифицирленген сегменті мен спецификалық олигонуклеотидті зонд арасында толық сәйкестік болса, онда фильтрде түрлі түсті нүкте қалыптасады. Бір фильтрге әртүрлі спецификалық олигонуклеотидті зондтардың толық қатарына сай келетін бірнеше нүкте салуға болады. Осы түрлі түсті мозаиканы анализдеу арқылы көптеген мүмкін болатын мутация сайттарының біреуін идентификациялауға мүмкіндік бар.

Молекулярлы диагностика – тез дамып келе жатқан бағыт. Оның негізгі принциптері қалыптасқанымен, жеке тесттердің техникалық бөлімдері (технические детали) айырмашылық жасайды. Қазіргі кезде ДНҚ-нысанның жеткілікті мөлшерін алу үшін ПЦР-ді тиімді пайдаланады. ПЦР мен спецификалық зондтарды қолдану тесттердің сезімталдыған жоғарылатады және радиоактивті емес хромогенді, хемилюминесцентті және флуоресцентті тіркеу жүйелерін пайдалануға мүмкіндік жасайды. Көбінесе мутацияны немесе инфекционды агенттің экзогенді ДНҚ-сын анықтау үшін өнімдерді келесілік электрофоретикалық бөлумен ПЦР жүргізу жеткілікті. ДНҚ-диагностикасы көмегімен көптеген, тіпті кең тараған генетикалық және инфекционды ауруларды, сонымен қатар жаңа туындағандардың барлығын дерлік анықтау мүмкіндігі күмән тудырмайды.