ДӘРІС № 4. БИОПОЛИМЕРЛЕРДІ ЗЕРДЕЛЕУДІҢ ӘДІСТЕРІ.

Биополимерлер — бұл тірі организмдермен синтезделетін жоғарымолекулярлы қоспалар. Олардың кейбіреуінің физикалық және химиялық қасиеттері бар және азық-түлік, қайта өңдейтін және фармацевтикалық өнеркәсіпте қолданылады. Рекомбинатты ДНК технологияларының пайда болуынан жаңа биополимерлер құруға, синтетикалық өнімдерді олардың биологиялық заттарымен ауыстыруға, физикалық және құрылымдық сипатын жақсарту мақсатында биополимерлерді түрлендіруге, өнеркәсіп процестерінің тиімділігін жоғарылатуға, олардың бағасын төмендетуге мүмкіндік туды.

Кстантты шырышты алу мақсатында Xanthomonascampestris рекомбинантты бактерияларды жасау.

Xanthomonascampestris — құнды коммерциялық биополимер, ксант шырышын, жоғары молекулярлы экзополисахаридті синтездейтін грамотеріс ауалы топырақты бактерия. Оның құрылымдық қаңқасы глюкоза молекуласынан құралған сызықтық полимерлі шынжырдан тұрады. Әрбір екінші глюкоза қалдығынаглюкоза қышқылының бір қалдығынан және маннозаның екі қалдығынан тұратын үшсахаридті бүйірлі шынжыр қосылған. Ксантты шырыш жабысқақ болып келеді, агрессивті физикалық және химиялық ортада бұзылмайды және физикалық, химиялық қасиеттері бойынша пластикке ұқсайды. Оны негізінде тұрақтанған, эмульгивті, суспендиялы агент ретінде қолдануға болады. Ксантты шырыштың жақсы коммерциялық өндірісі үшін X. campestris арзан және қолжетімді көміртекте өсіру керек. X. campestris лактозадан басқа глюкозаны, сахарозаны және крахмалды пайдаға асырып жатыр. Ірімшікті өндірген кезде сарысу көп бөлінеді. Оның құрамында су (94—95%), лактоза (3,5—4%), ақуыз, минералды заттар және төменмолекулярлы органикалық қоспалар бар. Сарысудың көп мөлшерін сүт өнімі береді, ал оның утилизациясы бұл үлкен мәселе. Көп жағдайда сарысуды өзен мен көлдерге құяды, соның салдарынан қажетті ауа азаяды және көптеген су организмдері жойылып кетеді. Қоқыс тастайтын жерге сарысуды апарып төгу өте қымбатқа түседі және грунт суларының ластауы мүмкін. Қаржының көбі сарысудың қатты компоненттерін жоюға жұмсалады. Осының барлығы сарысуды тиімді өңдеудің тәсілдерін табуға мәжбүрледі.

Сарысуды құнды өндірістік микроорганизмдерді өсіргенде көміртек көзі ретінде қолдануға болады. X. campestris сарысуда өсу қабілетіне ие болу үшін келесі тәсіл жүргізілген. lacZY E. Coli гендерін, галактозидаза мен лактозопермеазаны, X. Campestris бір бактериофагасының бақылауында болатындай плазмидаға енгізген. Бұл конструкцияныE. Coli, содан кейін X. Campestris ауыстырған. Плазмидасы бар трансформанттарды көміртектің негізгі көзі ретінде глактозаны қолдана отырып синтездеген, сонымен қатар көміртекті, глюкозаны, лактозаны және сарысуды қолдана отырып, көп мөлшерде ксант шырын шығарған. X. Campestris глюкозада өскен жағдайда ғана көп мөлшерде ксант шырын шығаратынын атап өту керек.

Меланин биосинтезінің гендерін шығару

Меланиндерсорып алатын биополимерлердің көптеген түрлерін жасайды, оларды жануарлар, өсімдіктер, бактериялар және саңырауқұлақтар синтездейді. Бұл пигменттерді күннен қорғайтын экран мен жамылғыларды жасауда, косметикалық құралдарға қосымша ретінде қолдануға болар еді. Қазіргі таңда меланиндерді табиғи көздердің экстракциясынан немесе химиялық синтез арқылы алады. Рекомбинантты ДНҚ технологиялары арқылы әртүрлі физикалық қасиеттері бар арзан ірі масштабты меланин өндірісін жасауға болады.

Меланиндер — бл индол, бензотиазол және аминқышқылы қалдығынан тұратын жүйесіз жүйелер. Олардың биосинтезінің бірінші кезеңі мыс құрамды ферментмонооксигеназойтирозиназбен катализденіп, тирозинді дигидроксифенилаланинхинонға дейін қышқылдандырады. Полимеризацияның соңғы кезеңі каталитикалық реакция емес, нехинонды қоспалардың химиялы табиғатына сәйкес әр түсті өнімдер береді: қара, қоңыр, сары, қызыл және күлгін.

Streptomycesantibioticus бактериалды клеткаларында меланин биосинтезінің гендері табылған. Оның құрамында екі ашық санау шеңбері (ORF) бар, оның біріншісі тирозиназаны (мол.массасы 30 600), ал екіншісі белгісіз функциялар арқылы ақуызды (мол.массасы 14 800) кодтайды. Осы екі геннің меланин синтезіне қажет екендігін анықтау үшін гендерді алдымен Е. соli векторына ауыстырады, мұнда бір конструкцияда тек қана тирозиназдың гендері ғана, ал екіншісінде тирозиназ және ORF43 гендері бар. Тирозиназ деңгейі маңызды емсе, ал меланин биосинтезі үшін екі геннің де өнімдері қажет. Табиғи жағдайда дигидроксифенилаланинхинон түзілгеннен кейін полимерге әртүрлі төмен молекулярлы қоспалар (нехинондар) кіреді. Осыны ескере отырып, әртүрлі көлемде төменмолекулярлы қоспаларды қоса отырып, меланиннің физикалық және химиялық қасиеттерін өзгертуге болады.

Адгезивті қасиеттері бар жануар биополимерлерінің микробиологиялық синтезі.

Mytilusedulis алғаш көрсетілген ақуызды алу әдісі анықталды. Бұл суға төзімді ақуыз өте мықты желілерді түзеді, сол арқылы моллюскалар әртүрлі жоғарғы қабатқа бекиді. Биополимер секрециясынан кейін полимерлік шынжырлар арасында көптеген көлденең сшивкалар түзіледі. Бұл гендердің нуклеотидті тізбегін құруға және гибридизациялы зондтарды жүйелеуге мүмкіндік бермейді. Осының негізінде адгезивті ақуыздың клетка ішіндегі негізгі көзін анықталды. Биохимиялық зерттеулер көрсеткендей ол серинге, треонинге, лизинге, пролинге және тирозинге бай болып келеді. 60-тан 70%-ға дейін аминқышқылдарының құрамында гилроксильді топтары бар, бірақ пролин мен тирозиннің көпшілігі 3 немесе 4 гидроксипролинге, 3,4 дигидроксипролинге гидроксилденген. Аминқышқылдарының тізбегі анықталғаннан кейін, оның негізі Ala-Lys-(Pro немесе Hyp)-Ser-(Tyr немесе DOPA)-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys декапептидтерінен тұратындығы анықталды.

Биссалды темір негізінде мРНК-н алынған кДНК қорынан адгезивті ақуыздың кДНК 130 кДа оқшауланған. Адгезивті ақуыз және кДНҚ ерекше қасиеттерге ие. Біріншіден, кДНК құрамында гомологинді рекомбинацияны көтеретін және тізбек бөліктерін жоғалтатын көптеген қайталаудан тұрады. Екіншіден, ақуыздың аминқышқылдарының 70%-ға жуығы пролиннің, лизиннің және тирозиннің еншісінде, сол себептен тРНК аминоацилдің көп мөлшерін алуға мүмкіндік жок.

Осы қиындықтарды жеңу үшін адгезивті ақуыздың немесе оның фрагменттері ашытқылы экспрессивті қатарға тұрып, осы векторларды ашытқылы клеткаға енгізген. Экспрессиядан кейін мол.массасы 20-100 кДа болатын адгезивті ақуыздың белсенді формалары алынған, бірақ олардың еншісінде 2-н 5 %-ға дейін клеткалы ақуыздың мөлшері бар. Адгезивті ақуыздың гені химиялық жүйеленгеннен кейін, экспрессия жоғары деңгейге жетті. Адгезивті ақуыздың декапептиді ДНҚ түрін қолдана отырып, ақуызды 25 кДа кодтаған ұзындығы 600 п.н. жететін синтетикалық генді жасады. Оның негізгі қайталанатын ұзындығы 30 п.н. болып келетін бірлігі Е. coli экспрессиясы үшін кодондардан құралған, ал маңыздысы Т7 фагасының бақылауында болған. Көптеген микроорганизмдер тек посттрансляциялықегидроксилирді аминқышқылды жүзеге асыруға қабілетті, сол себептен ақуыз соңына дейін гидроксилді болмайды. Оның кейбір тирозинді қалдықтары DOPAкөшірілмейді. Осы мәселені шешу үшін invitro гидроксилді жүйе құрылған, онда бактериалды тирозиназ аскорбин қышқылының негізінде тирозиннің қалдығын гидроксилдендірді. Охинондағы DOPAқалдығының қышқылдануын тоқтату үшін аскорбин қышқылын реакциялық қоспаға қосқан. Бұл процесс қатаң қадағалну керек, өйткені ол адгезивті ақуыздың бірліктерін қосуға әкеледі. Көптеген басқа да желімдер немесе адгезивтер сияқты, адгезивті ақуызды қолданар алдында активтендіру қажет.

Қышқылдану кезінде адгезивті ақуыз шынының, полистиролдың және коллагеннің жоғары қабатымен байланысты. Байланыс беріктілігі мен ерекшелігі адгезивті ақуыздың қоспасына басқа ақуыздарды қосып өзгертуге болады. Бұл ерекше қасиеті бар желімдерді және медицинада соның ішінде стоматологияда қолдануға болатын түрлерін шығаруға мүмкіндік береді.

Каучуктың микробиологиялық синтезі

Цис-1,4-полиизопрен табиғи каучугі – әртүрлі өсімдіктерден алынатын кеңінен қолданылатын биополимер. Оның биосинтезі қарапайым қанттың айналуынан басталады және құрамында 17 ферментативті реакциялары бар. Соның соңғысында аллилпирофосфат түзілетін изопентенилпирофосфаттың полимеризациясы жүреді. ORF438 кодтайтын белок мыс иондарын белсенді емес негізін салушы тирозиназыапотирозиназаға жеткізуі мүмкін. Ол мыс иондары болған жағдайда активтенеді. Табиғи шарттар бойынша дигидроксифенилаланинхинонның тирозиназа қатысымен түзілуінен кейін полимерге әртүрлі төменмолекулалы қосылыстар (незинондар) қосылады. Осының есебінен осы полимер биосинтезінің негізгі гендері енгізілген Е. coli жасушаларында синтезделетін меланиннің химиялық және физикалық қасиеттерін өзгертуге болады.

Адгезивті қасиеттері бар жануар биополимерінің микробиологиялық синтезі.

Алғаш рет Mytilusedulis мидийден бөлініп алынған адгезивті қасиеттері бар ақуыз алудың қымбат емес тәсілдерін жобалау әлдеқайда перспективті болып саналады. Бұл суда ерімейтін ақуыз өте мықты жіпшелер түзеді. Солардың көмегімен малюскалар әртүрлі беттергі жабысады. Бірден биополимер секрециясынан кейін биссаловоя железа деп аталатын полимерлі тізбектің арасында көптеген көлденең тігістер түзіледі. Сол тігістер олардың аминқышқылдарының реттілігін анықтауды қиындатады. Бұл өз кезегінде гибридизационды зондтарды синтездеуге және олардың гендерін кодтайтын нуклеотидті реттілікті орнатуға мүмкіндік бермейді. Адгезивті ақуыздың жасушаішілік негізін салушыны (130 кДа- негіз салушы (предшественник))бөліп алуға мүмкіндік туды. Биохимиялық зерттеулер көрсеткендей, оның құрамында бағалы серин, треонин, лизин, пролин және тирозин бар. Осы аминқышқылдарының 60-70%-ын гидроксильдік топ құрайды, сонымен қатар көптеген пролин мен тирозиннің қалдықтары 3- немесе 4- гидроксипролинге (Hyp) және сәйкесінше 3,4-дигидроксифенилаланинге (DOPA) гидроксилденген. Одан басқа аминқышқылдарының реттілігі анықталған соң, негіз салушы көбінесе қайталанатын декапептидтерден тұратыны белгілі болды ( Ala-Lys-(Pro немесе Hyp)-Ser-(Tyr немесе DOPA)-Hyp-Hyp-Thr-DOPA-Lys )

Биссальді темірден бөлініп шығарылған, мРНК негізінде алынған кДНК кітапханасынан адгезивті ақуыздың негізін салушы - кДНК 130 кДа изолирленді, және оның кДНК-сы клондауды күрделендіретін, сәйкес гендерлің экспрессиясы және функционалды адгезивті ақуыз алу сияқты ерекше қасиеттерге ие. Біріншіден, кДНК-да қайталаудың саны көп, ол өз кезегінде гомологы рекомбинация мен клондалған реттілік бөлігінің жоғалу мүмкіндігін жиілетеді. Екіншіден, ақуыз аминқышқылдарының 70%-ы пролин, лизин және тирозиннің үлесіне тиетіндіктен, көп мөлшерде жасушаішілік аминоацил-тРНК пулын алу екіталай.

Осы қиындықтарды өткеру үшін адгезивті ақуыздың толықөлшемді кДНК-сын немесе оның фрагментін ашытқылы экспрессирлеуші векторларға құрастырды және осы векторларды ашытқылы жасушаларға енгізді. Экспрессиядан кейін мол.массасы 20-дан 100кДа болатын адгезивті ақуыздың жаңа белсенді формалары алынды, жасушалық ақуыздардың суммарлы мөлшерінің 2-ден 5% дейінгі үлесі олардың еншісінде болды. Адгезивті ақуыз генінің химиялық синтезінен кейін ғана экспрессия өзінің айтарлықтай жоғарғы деңгейіне жетті.

Адгезивті ақуыздың декапептидті кодтайтын ДНК қайтамаларын қолдана отырып, мол.массасы шамамен 25кДа болатын ақуызды кодтайтын, ұзындығы 600п.н. болатын синтетикалық генді шығарды. Оның 30п.н. ұзындықтағы негізгі қайталанатын бірлігі Е. coli экспрессиясында оптимальды кодондардан тұратын, ал эффективті экспрессия ол Т7 фаг промоторының бақылауында болған кезде жүзеге асқан. Микроорганизмдердің басым көпшілігі аминқышқылдарын посттрансляционноегидроксилдеуді жүзеге асыру қасиеті шектелген, сондықтан түзілетін ақуыз соңына дейін гидроксилденбеген болады. Осылай оның тирозин қалдықтарының кейбірі DOPA-ға айналмайды, бұл түзілетін көлденең тігістердің түзілу мөлшерін азайтады. Бұл мәселені шешу үшін, құрамында аскорбин қышқылы болғанда тирозин қалдықтарын гидроксилдейтін бактериалды тирозиназасы бар invitroгидроксилдеу жүйесі құрылған. Аскорбин қышқылын DOPA қалдықтарын охинонға дейін тотығуын алдын алу үшін қосады. Бұл процесс адгезивті ақуыздардың суббірліктерінің құрастырылуына әкелетіндіктен(сшивание) қатаң бақылауда болуы керек. Өзге желімдер немесе адгезивтер сияқты адгезивті ақуыздарды қолданар алдыда міндетті түрде активтендіру қажет.

Адгезивті ақуыздың негізін салушы тотыққан кезде және тігістер түзілу барысында ақуыз әртүрлі беттік аудандармен байланысуы мүмкін (мысалы, шыны, полистирол, коллаген және т.б.). Байланысу мықтылығы мен ерекшелігін қоспаға тотығуға дейін және басқа ақуыздардың тігісі түзілгенге дейін адгезивті ақуыздарды қосу арқылы өзгертуге болады. Бұл әрекет арқылы медицинада, стоматологияда қолдануға болатын, бірегей қасиеттерге ие желімдерді шығаруға мүмкіндік береді.

Каучуктың микробиологиялық синтезі.

Табиғи каучук, цис-1,4-полиизопрен, - бұл әртүрлі өсімдіктерден алынатын, кең қолданылатын биополимер. Оның биосинтезі қарапайым қанттардың түзілуінен басталады, сондай-ақ 17 ферментативтік реакциялардан тұрады. Соңғы реакциялар жүзеге асу барысында изопентенилпирофосфаттың аллилпирофосфат түзуімен жүретін полимеризация реакциясы жүреді.

Каучуктың үлкен коммерциялық құндылығына орай зерттеулер жүргізілген. Бұл зерттеулер каучукты алу үшін рекомбинантты микроорганизмдерді қолдануға болатынын немесе болмайтындығын анықтауға бағытталған. Ең алдымен каучук синтезделетін Heveabrasiliensis өсімдігінен алынған мРНК көмегімен кДНК-кітапханасы шығарылды. Сосын қысқа ДНК-зондпен гибридизация жүргізілді. Клондалған кДНК шынымен де осы ферментті кодтайтынын дәлелдеу үшін, тазаланған ферментке антиденелер қолданылған. Сонымен, осы кДНК клонын және мүмкіндігінше каучук биосинтезінің өзге гендерін қолданып, микробиологиялық әдістермен табиғи каучук синтездеуге тырысып көруге болады. Бір жағынан, осы кДНК көмегімен каучук полимеразасын алуға және invitro-ның каталитикалық жүйесін құрастыруға мүмкіндік болар еді. Каучук биосинтезінің жаңа жолдарын жобалауға әкелетін кез келген зерттеулерді жалғастырудың мағынасы зор, басқаша айтқанда жақсы нәтижеге жетуге болады.

Полигидроксиалканоаттардың микробиологиялық синтезі.

Полигидроксиалканоаттар — бұл көптеген микроорганизмдермен синтезделетін (әсіресе, Alcaligeneseutphus) және жасушаішілік көміртек пен энергия көзі ретінде қолданылатын, биодеградацияланатын полимерлер. Олар құрамына байланысты әртүрлі қасиеттерге ие және қаптама материалдарын жасауда қолданылатын биодеградацияланған пластмасс алу үшін қолданылуы мүмкін. Бағалау бойынша биодеградацияланған пластмассалардың жылдық сату көлемі шамамен 1,3 млрд. долларды құрайды.

Барлық полигидроксиалканоаттардың ішінде толық қарастырылып, сипатталғаны поли (3-гидроксимайлы қышқыл) болып табылады. Бұл полимердің өзіне де, оынң синтезін кодтайтын A. eutrophus гендеріне де қатысты болып келеді. Полиді (3-гидроксимайлы қышқылды), оның сополимерін поли (3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) және басқа полиоксиалканоатты, полиді (3-гидроксивалерианды қышқылды) Ұлыбританияда өнеркәсіптік масштабта A. Eutrophus қатысындағы ферментация көмегімен алады.

Алайда бұл микроорганизм баяу өседі және көміртек көздерінің тек шектеулі мөлшерін қолданады. Сондықтан өндіру аса қымбат болып келеді. Басқа жолды қолдануға болады мысалы: осы полимер биосинтезінің гендерін Е. coli –ге тасымалдау барысында тез өсетін, поли-дің (3-гидроксимайлы қышқыл) үлкен мөлшерін (жасушаның құрғақ массасының 95%-на дейін) жинақтаушы трансформаттар пайда болады. Поли (3-гидроксимайлы қышқылы) ацетил-СоА-дан әртүрлі үш фермент көмегімен катализделетін үш сатылы әдіспен синтезделеді. Осы гендердің ішіндегі оперон ұзындығы 5,2 т.п.н.болатын фрагмент құрамының плазмидасында құрылған. Алайда селективті қысымның болмаған жағдайында, мысалы, антибиотиксіз өсу кезінде, Е. Coli жасушаларының жартысына жуығы 50 генерациядан кейін-ақ берілген плазмидадан айырылған болатын. Бұл культивирлеу масштабы аз болған жағдайда аса маңызды емес, бірақ ірі масштабты немесе үздіксіз ферментация кезінде күрделі мәселеге айналады. Дәл осы қиындықтан айналып өту үшін полиді (3-гидроксимайлы қышқылын) тасымалдаушы плазмидаға басқа плазмидадан раrВ локусын құрастырды. Бұл сегрегациядан кейін құрамында плазмидасы жоқ жасушалардың өліміне себепші плазмидтердің стабилизациясын қамтамасыз етеді. Модификацияланған плазмидтер поли (3-гидрокси-майлы қышқылы) конститутивті синтезі кезінде де тұрақты болып қала берген. Берілген өнімді синтездейтін Е. Coli трансформанттары тек өте аз мөлшердегі жасуша өліміне душар ететін ацетат түзетін. Көрінгендей, барлық артық мөлшердегі ацетил-СоА ацетатқа емес полиге (3-гидроксимайлы қышқылына) айналды. Е. coli –де поли (3-гидроксимайлы қышқылы) синтезінің тағы бір артықшылығы, оны хлорноватистоқышқылды натрий (калий) деп аталатын сілтілік ерітіндімен экстрагирлегенде (A. eutrophus.-дан эекстракциялағанмен салыстырғанда) аздаған мөлшерде бөлінеді. Байқалғандай, бұл Е. Coli-дегі синтезделетін полимерлердің басым көпшілігі кристалл күйінде болады, ал сол мерзімде A. Eutrophus-те аморфты күйде болады. Осыған қарамастан осы екі әдіспен алынатын полимерлер ұқсас болып келеді.

Поли (3-гидроксибутират-со-3-гидроксивалерат) өзінің полипропиленге кеңінен қолданылатын қасиеттеріне байланысты аналогты болып келеді. Сондықтан оны микробиологиялық әдістермен алу коммерциялық қызығушылық тудыруы мүмкін. Дегенмен, полимер биосинтезінің гендері экспрессияланатын Е. Coli штаммдары сополимерлерді емес тек қана поли (3-гидроксимайлы қышқылын) синтездейді. Бұл мәселені Е. Coli жасушаларының экспрессиясы үшін fadR және atoC құрылымдарындағы мутацияны тасымалдаушыларды қолдана отырып шешуге болады. FadR майлы қышқылдардың биосинтезінің негативті регуляциясына жауапты, ал atoC – олардың жұтылуының позитивті регуляциясына жауапты. FadR локусының сополимер бисоинтезінің индукциясындағы ролі белгісіз, бірақ atoC генінің өнімі atoA, atoA және қоректік ортадан бактерияның пропионатты сіңіруін жеңілдетуші гендермен кодталатын ақуыздардың синтезіне әсер етеді. Соңғысы пропионил-СоА-ға айналып, сополимерге кіретін, өз кезегінде 3-гидроксивалерил-СоА-ге де айналып кете алатын 3- кетовалерил-СоА-ді түзе отырып, ацетил-СоА мен реакцияға түседі.

Бактерияларды рестриктаза типінің ақуыздарын синтездеуге арналған «фабрика» ретінде ғана қолданып қоймай, сонымен қоса олардың көмегімен бактериалды жасушалардың метаболизмін оларға басқа текті гендерді немесе белгілі модификацияларды енгізе отыра өзгертіп, жаңа өнім алуға да болады. L-аскорбин қышқылын, индиго бояғышын, аминқышқылдарды, антибиотиктерді, әртүрлі полимерлердің мономерлі бірліктері сияқты әртүрлі төменмолекулалы қосылыстарды синтездеуге қабілетті рекомбинантты микроорганизмдерді жасауға болады.

Осылардың негізінде жалпы стратегия – бір немесе бірнеше ферменттерді кодтайтын,жарамды векторда клондалған спецификалық гендердің иесін енгізу болып саналады. Барлық берлігендерге қарағанда жаңа метаболиттік жолдардың жасалуы техникалық жағынан жүзеге асу мүмкіндігі бар. Бұл тәсіл әртүрлі қосылыстардың синтезінің эффективті жолдарын жасауға мүмкіндік береді.