ДӘРІС № 7. БИОТЕХНОЛОГИЯДАҒЫ ИММУНОЛОГИЯЛЫҚ ӘДІСТЕР.

Детекцияның көптеген иммунологиялық жүйелері қарапайым бола тұра, жоғары сезімталдық пен спецификалылыққа ие. Олар дәрілік препараттарды тестілеуде, әртүрлі онкологиялық аурулардың мониторингін бағалауда, спецификалық метаболиттерді анықтауда, патогенді микроағзалардың идентификациясы мен бақылауында кең қолданылады, бірақ өзіндік кемшіліктері де бар. Егер молекула-нысан ақуыз болса, онда оның детерминирлейтін гендерінің экспрессиясын қамтамасыз ету және антиденемен байланысатын сайттың жасырынуы (маскирование) немесе бұғалуы болмайтын шарттарды қалыптастыру керек. Инфекция қоздырғыштарын диагностикалаудың дәстүрлі процедуралары патогенді микроорганизмнің сипаттамалар жиынына немесе оның бірегей, оңай ажыратылатын ерекшелігіне негізделеді. Клиникалық микробиологтар оның көмегімен патогенді микроағзаларды табуға және идентификациялауға кепіл болатын биологиялық сипаттамалардың минималды жиынын табуға тырысуда. Мысалы, кейбір қоздырғыштар биологиялық үлгіде анықтау қажет арнайы биохимиялық қосылыстарды түзеді. Көбінесе мұндай маркерлі молекуланы жоғарыспецификалық биохимиялық анализ көмегімен анықтауға болады. Бірақ бұл әрекет патогенді микроорганизмдердің детекциясының жекеленген (индивидуализированный) жүйелерінің санының көбеюіне әкелеп соғады. Анағұрлым қолайлы болып, кез келген маркерлі молекуланы оның химиялық табиғатына тәуелсіз анықтауға мүмкіндік беретін әмбебап әдіс саналады. Антиген-антидене кешенінің идентификациясына негізделген әдіс дәл сондай әдіс болып табылады.

Ферментті иммуносорбентті анализ

Антидененің антиген-нысанмен байланысқанын анықтауға мүмкіндік беретін түрлі жолдар бар. Олардың бірі – диагностикада көп қолданылатын ферментті иммуносорбентті анализ (ELISA). Процедура келесі этаптардан тұрады.

1. Спецификалық молекула немесе микроорганизмді анықтайтын үлгіні қатты төсемеге (подложка), мысалы 26 қуысы бар пластикалық микротитрлеуші кесіндіге бекітеді.

2. Бекітілген үлгіге маркерлі молекулаға сезімтал антиденені енгізеді, содан кейін бірінші антидененің байланыспаған молекулаларынан кетіру үшін, қуысты шаяды.

3. Бірінші антиденемен өзіндік (специфический) байланысатын және маркерлі молекуламен әрекеттеспейтін екінші антиденені енгізеді. Бұл антиденеге бояламаған субстраттың боялған өнімге айналуын катализдейтін фермент жалғанған (мысалы, сілтілік фосфатаза, пероксидаза немесе уреаза). Екінші антидене-фермент конъюгатының байланыспаған молекулаларын жою үшін қуысты жуады.

4. Боялмаған субстрат енгізеді.

5. Боялған өнімнің сапалық немесе сандық анықтауын жүргізеді.

Егер бірінші антидене үлгі нысанымен байланыспаса, онда ол алғашқы рет шайғанда жойылады. Бұл жағдайда екінші антидене-фермент конъюгатының байланысатын заты жоқ болғандықтан, ол екінші рет жуғанда жойылады және үлгі боялмай қалады. Егер нысанмен байланысу жүрсе, онда екінші антидене біріншімен бірігеді, конъюгирленген фермент жеңіл тіркелетін боялған өнімнің қалыптасуын катализдейді.

ELISA-ның негізгі қағидасы (принципі) – бірінші антидененің нысанмен спецификалық байланысуы. Егер молекула-нысан ақуыз болса, онда оның тазаланған препаратын берілген нысанды анықтауға көмектесетін антиденелерді алу үшін пайдаланады. Иммунизирленген жануардың (әдетте қоян) қанының сарысуында пайда болатын антиденелер, молекула-нысанның әртүрлі антигенді детерминанттарымен (эпитоп) байланысады. Антиденелердің мұндай қоспасын поликлональді препарат деп атайды. Поликлональді антиденелерді пайдаланудың екі кемшілігі бар: 1) поликлональді препараттағы жекеленген антиденелер бір партиядан екінші партияға түрленіп кетуі мүмкін; 2) егер екі ұқсас нысандарды ажырату керек болса, яғни патогенді (нысан) немесе патогенді емес (нысан емес) формалар бір ғана детерминанттымен айырмашылық жасағанда, поликлональді антиденелерді қолдануға болмайды. Дегенмен қазіргі кезде бір антигенді детерминантқа арнап шығарылған, яғни моноклональді антиденелер препаратын алуды үйренгеннен соң, бұл мәселелерді шешуге мүмкіндік туды.

Моноклональді антиденелер

Эволюция барысында сүтқоректілерде организмді токсикалық заттардан және инфекционды агенттерден қорғайтын жасушалар жүйесінің күрделі жиыны қалыптасты. Қорғаушы реакцияның құрамдас бөлігі болып бөтен заттармен (антиген) байланысатын және иммунды жүйенің басқа ақуыздарының көмегімен, комплемент жүйесін қоса есептегенде, олардың әсерін бейтараптайтын, спецификалық ақуыздардың лимфатикалық жүйесінің жасушалармен индуцирленген өндірілуі табылады. Иммунологиялық ынталануға (стимул) жауап ретінде әрбір антидене продуцирлеуші жасуша антиген молекуласының жеке бөлігін (эпитоп, антигенді детерминант) жоғары ұқсастықпен (сродство) танитын антидененің бір ғана түрін синтездейді және бөледі. Әдетте антиген молекуласында бірнеше әртүрлі эпитоптар болатындықтан, олардың әрқайсысына қарсы антиденелер иммунды жүйенің жеке жасушаларынан бөлінеді. Мұндай, берілген антигенмен әрекеттесетін әрбір антиденелер поликлональді деп аталады.

Осы ғасырдың басында, антиденелердің поликлональділігі туралы ештеңе белгісіз болғанның өзінде, олардың ерекшелігін (специфичность) инфекцияны басуда қолдануға болатыны анық еді. Кейіннен антиденелерді клиникалық үлгілердегі токсикалық қосылыстарды анықтайтын диагностикалық құрал ретінде пайдалана бастады. Өкінішке орай, кейбір жағдайда иммунизациялаған кезде антидене продуцирлеуші жасушалар берілген антигеннің бір детерминанттарымен қаттырақ стимулденетіндіктен, басқа жағдайда иммунды жүйе сол антигеннің басқа эпитоптарына белсендірек жауап беретіндіктен, поликлональді антиденелердің препараттарының әсері бір партиядан екінші партияға түрленеді (варьирует). Жеке эпитоптар түрлі әсер ететіндіктен (ынталандырушы қабілет), бұл әр түрлі препараттардың антигендерді бейтараптау қабілетіне ықпал етуі мүмкін. Демек, поликлональді антиденелердің берілген партиясында негізгі эпитопқа қарсы бағытталған молекулалар аз болуы мүмкін, соның нәтижесінде оның әсері алдыңғыға қарағанда анағұрлым төмен болады.

Антиденелерді диагностикалық құрал немесе терапиялық заттар компоненті ретінде тәжірибеде қолдану үшін, культурада өсетін және антиденелердің антиген-нысанға өте ұқсайтын бір ғана түрін продуцирлейтін жасушалар линиясын – моноклональді антиденелерді шығару керек болды. Мұндай жасушалық линия антиденелердің идентикалық молекулаларының таусылмас қоры бола алар еді. Өкінішке орай, антиденелерді синтездейтін B-лимфоциттер (В-жасушалар) культурада көбейе алмайды. Мәселенің шешімі гибридті жасушаны жасап шығаруда болды. В-жасушадан генетикалық бірлікті алғаннан кейін, ол антиденелерді шығарып, сәйкес жасуша түрінен бөліну қабілетіне ие болып, культурада өсе алатын еді. В-лимфоциттер кейде қайта пайда болып, культурада өсу қабілеті мен В-жасушалардың көптеген қасиеттерін сақтай отырып ісік (миеломды) клеткаларына айналатыны белгілі болды. Осылай миеломды клеткалар, бірінші кезекте антиденелерді бөлмейтіндер, антиденені продуцирлеуші В-жасушалармен бірігетін үміткерлерге айналды. 70-ші жылдардың ортасында бұл идеялар іске асты.

Бір типті антиденелерді продуцирлейтін гибридті клеткалар линиясын алу процесіндегі алғашқы қадам болып тышқандарға антигендерді енгізу табылады. Бірнеше апта бойы жүргізілген иммунизациядан кейін, жануарларда иммунды жауаптың дамуы болғанын тексереді. Егер жауап болса, онда жануарларды өлтіреді, көк бауырын алып, оны жуады, ұсақтайды және ішінде антидене продуцирлеуші В-жасушалары бар жекелеген жасушалардың босатылуы үшін әлсіз сілкиді. Көк бауыр жасушаларының қоспасын гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазаға (HGPRT-) ақаулы миеломды жасушалар қоспасымен араластырады. Комбинирленген қоспаны бірнеше минут бойы 35%-дық полиэтиленгликольде инкубирлейді, сосын гипоксангин, аминоптерин және тимидин (ГАТ ортасы) бар ортаға ауыстырады.

Полиэтиленгликольмен өңдеу жасушалардың бірігуін жеңілдетеді, дегенмен бірігу сирек болады және жеткілікті деңгейде кездейсоқ жағдай болып табылады. Қосапада миелома, көк бауыр жасушалары, сонымен бірге біріккен миелома – көкбауыр, миелома – миелома, көкбауыр – көкбауыр жасушалары бар. Алайда ГАТ ортасында тек миелома – көкбауырдың гибридті жасушалары ғана өседі, ал басқа типті жасушалар онда пролиферирлене (пролиферировать) алмайды. Көкбауыр және біріккен көкбауыр – көкбауыр жасушалары культурада мүлдем өспейді, ал HGPRT-дің миеломды жасушалары және біріккен миелома – миелома жасушалары гуанин және адениннің пуринді негіздерінің биосинтезі процесінде гипоксантинді алғызат ретінде пайдалана алмайды. Бірақ оларда пуриндер синтезінің басқа табиғи жолы бар – ол дигидрофолатрекдуктазаның қатысымен жүреді, сондықтан орта құрамына осы ферменттің белсенділігін ингибирлейтін аминоптерин қосылады. Осыған байланысты HGPRT-дің миеломды жасушалары және біріккен миелома – миелома жасушалары ГАТ ортасында пуриндерді синтездей алмайды және жойылады.

Көкбауыр – миелома жасушалары ГАТ ортасында өседі, себебі: 1) көкбауыр жасушалары дигидрофолатредуктазаның қатысында пуриндер синтезінің аминоптеринмен бұғалуына қарамастан, ортаның экзогенді гипоксантинін утилиздей алатын функционалды HGPRT жеткізеді; 2) миелома жасушалары белсенді бөліне алады. Тимидин дигидрофолатредуктазаның ингибирленуімен шартталған пиримидин синтезінің бұғалуын болдырмауға қажет. ГАТ ортасында жасушалардың бірігуінен кейін, 10-14 тәуліктерде тек біріккен көкбауыр-миелома жасушалары қалады және дамиды. Сосын оларды пластикалыө микротитрлеуші кесінділердің қуыстарына (лунка) енгізеді және ГАТ-сыз толық культуралды ортада өсіреді.

Енді иммунизирлейтін антигенге арналған антиденелерді өндіретін гибридті жасушаларды идентифицирлеу керек. Бұл үшін әдетте секреттелетін антиденелері бар культуралды орталардың скринингін жүргізеді. Дамушы жасушалары бар қуыстардан жасалған орталарды бөліп алады және қуыстарды басқа, алдын ала антиген-нысан молекуласының қабатымен қапталған микротитрлеуші кесіндіге ауыстырады. Егер культуралды ортада берілген антигеннің бір эпитопын танитын антидене (бірінші антидене) болса, онда ол антигенмен байланысады және қуыстарды жуған соң сонда қалады. Содан кейін қуыстарға тышқан антиденелеріне сезімтал (специфичный) екінші антиденені енгізеді. Ол антигенмен байланысқан кез келген бірінші антиденеге қосылады.

Иммунды анализде қолданылатын екінші антиденеге боялмайтын субстратты боялған қосылысқа айналдыратын ферментті алдын ала қосады. Қуыстардың бірінде түстің өзгеруі бастапқы культуралды ортада берілген антигенге сезімтал антидененің болғанын білдіреді. Егер мұндай антидене ортада болмаған болса, онда екінші антиденеге байланысатын зат болмайды және ол екінші рет жуғанда шайылып кетеді. Мұндай қуыстардағы субстрат боялмаған күйде қалады.

Оң иммунды жауап беретін (түстің өзгеруі) ортасы бар, бастапқы микротитрлеу кесіндісіндегі қуыстарда құйылған жасушалар қоспасы болуы мүмкін. Бір жасушадан дамыған линиялар алу үшін (клондар), осындай қуыстардан жасалған жасушалық суспензияны культуралды ортамен араластырады да, басқа қуыстарға отырғызады. Алынған клондарды культивирлегеннен соң орталарды қайта тексереді, антиген-нысанды танитын моноклональды антиденелерді қай жасушалық линия (гибридома) продуцирлейтінін анықтайды. Бірден көп өзіндік (специфичный) гибридомалар алған жағдайда, ары қарай түрлі клондардан өндірілетін антиденелер бір антигенді детерминантқа қарсы бағытталды ма, жоқ па екенін анықтайды. Моноклональды антидене продуцирлейтін әрбір клонды культурада шексіз ұстауға болады. Сондай-ақ, үлгілерді сұйық азотта қатырып, ары қарай оларды жасушалар көзі ретінде пайдалануға болады.

Бір ғана, қатаң түрде анықталған антигенді сайтпен ғана байланысатындықтан, моноклональды антиденелерді қолдану ELISA әдісінің ерекшелігін арттырады. Қазіргі кезде әртүрлі қосылыстар мен патогенді микроорганизмдерді анықтауда қолдануға болатын бірқатар моноклональды антиденелер алынған. E. coli көмегімен антиген-нысанға қарсы бағытталған моноклональды антиденелер мен олардың бөліктерінің (Fv-фрагменттер) таңдалып алынуы және өндірілуі гибридомды жасушалар культурасынан моноклональды антиденелерді алудың альтернативі болуы мүмкін.