Структура эукариотических генов.

Строение и организация эукариотических генов значительно сложнее, чем у прокариот. Отчасти это обусловлено использованием трех разных систем транскрипции.

Гены класса I, кодирующие 5,8S-, 18S- и 28S-рРНК, транскрибируются РНК-полимеразой I. Все мРНК и ряд малых ядерных РНК (мяРНК) образуются при транскрипции генов класса II с участием РНК-полимеразы II. тРНК и некоторые малые цитоплазматические РНК (мцРНК) образуются при транскрипции генов класса III с участием РНК-полимеразы III.

Естественно, для инициации транскрипции с участием трех разных РНК-полимераз используются разные регуляторные последовательности, при этом они располагаются каждая на определенном расстоянии от точки начала транскрипции. Кроме того, для РНК-полимеразы каждого типа требуются свои вспомогательные белки – факторы транскрипции, которые связываются с этими регуляторными последовательностями.

Последовательности, которые определяют 3'-конец соответствующих функциональных РНК-продуктов (терминаторы) тоже уникальны для каждой полимеразной системы. Они зачастую многочисленны.

В отличие от прокариотических генов, почти всегда коллинеарных своим РНК, многие гены эукариот имеют мозаичное строение, т.е. у них чередуются кодирующие (экзоны) и некодирующие (интроны) последовательности в пределах единицы транскрипции. Интроны чаще всего встречаются в генах, кодирующих белки и тРНК, и реже в генах рРНК. За исключением некоторых генов, кодирующих пять гистонов, интерфероны и белки некоторых вирусов млекопитающих, все гены, кодирующие белки позвоночных, содержат интроны. Редко встречаются интроны в генах дрожжей, отсутствуют почти во всех генах Drosophila. Интроны присутствуют также во многих растительных генах.

Размеры, число и местоположение интронов у разных генов различны. Тем не менее, сходные гены у организмов разных видов часто имеют одинаковое число интронов в одних и тех же позициях, хотя длина и нуклеотидная последовательность интронов могут заметно различаться. Обычно число интронов на ген возрастает пропорционально длине последовательности, кодирующей белок, а размеры экзонов в среднем составляют около 300 п.н. В целом общая длина последовательностей интронов превышает суммарную длину экзонов обычно от двух до десяти раз, а иногда и больше.

Таким образом, к сегментам ДНК, составляющим ген, относятся:

1. Единица транскрипции, которая представляет собой протяженный участок ДНК, кодирующий последовательность первичного транскрипта; в нее входят а) последовательность, кодирующая либо зрелую РНК, либо белковый продукт; б) интроны; в) 5'-лидерная и 3'-трейлерная последовательности, которые присутствуют в зрелых мРНК, а также промежуточные последовательности (спейсеры), которые удаляются в ходе процессинга первичных транскриптов генов, кодирующих РНК.

2. Минимальные последовательности, необходимые для начала правильной транскрипции (промоторы) и для образования правильного 3'-конца зрелой РНК.

3. Последовательности, регулирующие частоту инициации транскрипции; к ним относятся последовательности, ответственные за индуцибельность и репрессию транскрипции, а также клеточную, тканевую и временную специфичность транскрипции. Эти области так разнообразны по строению положению и функциям, что для них трудно найти одно простое и емкое название. К их числу относятся энхансеры и сайленсеры – последовательности, которые оказывают дистанционное влияние на инициацию транскрипции независимо от своей ориентации относительно точки начала транскрипции.

3. . Организация генома прокариот.

У E. coli гены, кодирующие белки одного и того же метаболического пути или определяющие близкородственные функции, часто регулируются согласованно. Это значит, что их экспрессия начинается и заканчивается или согласованно продолжается в ответ на один и тот же регуляторный сигнал. Гены, подчиняющиеся согласованной регуляции, в геноме часто бывают сцеплены и транскрибируются с промотора, находящегося на 5'-конце такой группы генов (кластера), в виде единственной молекулы РНК, называемой полицистронным транскриптом. Группа координированно экспрессирующихся генов называется опероном.

Три гена, кодирующие ферменты, ответственные за метаболизм галактозы у E. coli, организованы в оперон с промотором (Р) и примыкающим к нему регуляторным сегментом – оператором (О) на 5'-конце транскрибируемой последовательности.

Как правило, отдельные опероны, кодирующие родственные функции, имеют одинаковые или сходные регуляторные последовательности и поэтому реагируют на определенный регуляторный сигнал сходным образом.

.

4. Регуляция экспрессии прокариотических генов.

Активность многих промоторов регулируется с помощью особых белков-регуляторов, которые присоединяются к определенным участкам ДНК и либо мешают, либо помогают РНК-полимеразе инициировать синтез РНК. В первом случае говорят о негативной, а во втором – о позитивной регуляции активности промотора.

Белки, осуществляющие негативную регуляцию, называются репрессорами. Места их связывания на ДНК называются операторами (рис.5) Способность многих репрессоров связываться со своими операторами зависит от низкомолекулярных лигандов – эффекторов. Эффекторы, снижающие сродство репрессора к оператору, называются индукторами. В отсутствие индуктора репрессор связывается с оператором и мешает РНК-полимеразе начинать синтез РНК с промотора (промотор репрессирован). В комплексе с индуктором репрессор теряет способность связываться с оператором, в результате чего промотор активируется (индуцируется). Другие репрессоры, наоборот, могут связываться с оператором только в комплексе с эффектором (который в этом случае называется корепрессором). В присутствии корепрессора промотор неактивен (репрессирован), в отсутствие корепрессора активируется (дерепрессируется).

Белки, осуществляющие позитивную регуляцию, называются активаторами. Ряд белков-регуляторов могут выступать как в роли репрессора, так и в роли активатора.

Простейший механизм репрессии заключается в стерическом блокировании репрессором присоединения РНК-полимеразы к промотору. Такой механизм имеет место в тех промоторах, в которых участок связывания репрессора перекрывается с участком связывания РНК-полимеразы. Простейший механизм активации заключается в том, что белок-активатор присоединяется к промотору рядом с РНК-полимеразой и за счет непосредственного контакта с ней облегчает образование открытого промоторного комплекса.

5. . Организация генома эукариот.

Точно так же, как различается строение эукариотических генов и генов прокариот, различается и организация геномов этих двух типов организмов. В бактериальном геноме гены почти непрерывно следуют один за другим по всей длине молекулы ДНК, а в некоторых случаях даже перекрываются. Гены, кодирующие ферменты одного метаболического пути, часто образуют одну единицу транскрипции (оперон). Это способствует наиболее эффективному использованию нуклеотидной последовательности ДНК. Но, по-видимому, для эволюции эукариот принцип экономии был не столь важен, как для эволюции прокариот. Не говоря уже о том, что большую часть ДНК занимают интроны, эукариотические гены разделены длинными некодирующими участками. Большое число генов в одной единице транскрипции встречается редко. Эукариотические геномы содержат гораздо больше ДНК, чем это представляется необходимым. В основном геномы млекопитающих и растений содержат в 20 – 50 раз больше ДНК, чем необходимо для кодирования генов. Существование «избыточной» ДНК отчасти можно объяснить тем, что в геноме имеются интроны и протяженные участки ДНК между генами – межгенные спейсеры.

Большой размер генома эукариот может объясняться и тем, что некоторые гены встречаются в геноме много раз. Свой вклад в «избыточную» ДНК вносят также нефункциональные копии генов, называемые псевдогенами.

Большой размер эукариотических геномов обусловлен также наличием в них множества повторяющихся последовательностей ДНК с неизвестными функциями. На их долю приходится обычно 10%, а в некоторых случаях почти 50% генома. При помощи кинетического анализа реассоциации денатурированной эукариотической ДНК было показано, что значительная часть ДНК ренатурирует гораздо быстрее, чем можно было бы ожидать для уникальных последовательностей ДНК. Высокая скорость реассоциации говорит о том, что такие геномы содержат фрагменты, повторяющиеся от сотен тысяч до миллионов раз. В настоящее время с помощью молекулярного клонирования и секвенирования подтверждено существование таких последоватнльностей ДНК с большим числом повторов, которые могут располагаться либо тандемно, либо изолированно друг от друга среди неродственных геномных локусов.

По скорости реассоциации ДНК эукариот разделяется на три фракции: быстро реассоциирующие (к ним относится высокоповторяющаяся или сателлитная ДНК), фракции со средней скоростью реассоциации (умеренно повторяющаяся ДНК) и медленно реассоциирующая ДНК (уникальные последовательности).

Фракция ДНК, включающая высокоповторяющиеся геномные последовательности, функционально и структурно обособленная часть генома, представленная сателлитными ДНК. В их составе имеются повторы из нескольких нуклеотидов. Главная повторяющаяся единица сателлитных ДНК называется базовой последовательностью и может состоять из 3 – 7 или даже из нескольких сотен нуклеотидов. К классу умеренно повторяющихся относят последовательности, представленные в геноме десятками и сотнями копий. К ним относятся семейства генов, построенные из сгруппированных тандемно повторяющихся копий. Это гены гистонов, тРНК и рРНК. В целом они составляют несколько процентов от всей геномной РНК. К ним также относятся мобильные генетические элементы (МГЭ) разной природы. На их долю приходится значительная часть генома – 10-20%.

Уникальные последовательности генома содержат не только гены, кодирующие белки, но и последовательности ДНК, расположенные между генами и интроны.