Терміни для запам'ятовування

ВСТУП

Гістологія(від грецького «гістос» — тканина — та «логос» — слово, наука) — наука про тканини багатоклітинних тварин та людини. Цю назву запропонував німецький вчений Р. Майєр у 1819 р. Однак обсяг і значення предмету гістології зараз ви йшли за межі дослівного пере кладу його назви. Гістологія вивчає не тільки тканини, але й клітини, з яких вони складаються, будову органів і систем організму. Згідно з цим існують такі розділи предмету, як цитологія (наука про клітину), загальна гістологія, або власне гістологія (вивчає тканини), спеціальна гістологія (вивчає будову органів і їх систем). Тісно пов'язана з гістологією також наука про роз виток зародка — ембріологія, тому що структури організму вивчаються у процесі їхнього виникнення і розвитку. Ембріологія як і цитологія нині відокремилися від гістології і є самостійними науками, але в навчальному курсі медичного інституту вони об'єднані в один предмет разом з гістологією. Таким чином, повна назва курсу — гістологія з цитологією та ембріологією.

Предмет гістології — тонка (мікроскопічна) та ультратонка (субмікроскопічна) будова структур організму, яка вивчається методом мікроскопії. Тонкими або мікроскопічними структурами називають такі, що не видні неозброєним оком, а лише під світловим мікроскопом. Ультратонкі або субмікроскопічні структури можна побачити під електронним мікроскопом. Мікроскопічний метод відрізняє гістологію від анатомії, яка теж вивчає будову організму, але на рівні того, що можна бачити неозброєним оком. Ці дві науки, а також топографічну та патологічну анатомії називають морфологічними (від грецького «морфос» — форма, що означає вивчення форми, тобто будови організму).

Гістологія як біологічна наука тісно пов'язана з рядом інших біологічних дисциплін і зокрема, крім вже згаданої анатомії, з фізіологією та біохімією. Ці чотири дисципліни є фундаментом медичної освіти. Гістологія безпосередньо контактує, у першу чергу, з курсом патологічної анатомії, успішне вивчення якого можливе лише при твердих знаннях про будову нормальних, патологічно незмінених структур. Крім того, гістологія створює необхідну базу також для вивчення ряду клінічних дисциплін — терапії, хірургії, акушерства та гінекології, офтальмології, оториноларингології, дерматології та інших.

Гістологічна наука має велику історію, багату іменами та фактами, для самого переліку яких треба було б присвятити цілий розділ. Але таке перечислення мало що дасть студентові, який тільки починає знайомство з предметом. У зв'язку з цим, історичні посилання, подані у відповідних розділах, і, таким чином, віддано шану тим вченим, які вписали свої імена в гістологічну науку.

Методи гістологічного дослідження.Сучасна гістологія має широкий арсенал різноманітних методів дослідження. Усі ці методи поєднує вимога застосування спеціального приладу — мікроскопа, і тому всі вони є мікроскопічними методами. Залежно від стану досліджуваного об'єкта, ці методи поділяють на вітальні (або суправітальні), коли вивчаються живі (або переживаючі) клітини, тканини, органи і навіть цілі організми, та поствітальні, коли досліджують мертві об'єкти, спеціально вбиті шляхом фіксації.

Становлення поствітального методу, або методу виготовлення постійного гістологічного препарату, відбувалося паралельно із становленням самої науки гістології у другій половині XIX ст. Його називають ще методом класичної гістології. Цей метод, що має назву гістологічної, або мікроскопічної техніки, вимагає досить складної підготовки об'єкта дослідження. Остання є предметом для написання спеціальних, досить великих за обсягом посібників. Студентові, який починає вивчати гістологію, необхідно ознайомитись з основами техніки виготовлення гістологічних препаратів для того, щоб краще зрозуміти ці препарати і навчитися їх аналізувати, «читати», бо саме постійні гістологічні препарати широко використовуються як в учбовому процесі, так і в наукових дослідженнях.

Першим етапом при виготовленні препарату є одержання матеріалу. Вже на цьому етапі, як і на всіх наступних, слід уникати зайвого травмування об'єкта. Для цього, при вирізуванні шматочка органа чи тканини, треба брати гострі ножиці або лезо, не стискати тканину пінцетом. Шматочки беруться невеликих розмірів — близько 1 см³ (краще 7х7х3 мм). Матеріал повинен бути свіжим, брати його треба якомога скоріше після забивання експериментальної тварини або смерті людини.

Наступним етапом є ф і к с а ц і я матеріалу, яка здійснюється шляхом занурення взятого шматочка у фіксуючу рідину. Метою цього етапу є закріплення гістологічних структур і макромолекул у тому місці і стані, в якому вони були у живому об'єкті. Звичайно, фіксатори викликають певні зміни прижиттєвого стану структур, але можна підбором спеціальних фіксуючих агентів звести ці зміни до мінімуму. Фіксаторами служать спирти (етиловий, метиловий), розчини формаліну, солі важких металів, кислоти (оцтова, пікринова, осмієва). Частіше вживають різні складні фіксуючі суміші, які включають названі компоненти у різних співвідношеннях.

Третій етап — обезводнення фіксованого матеріалу. Для цього використовують спирти зростаючої концентрації (від 50 до 100 градусів). Обезводнення необхідне для наступного етапу — ущільнення об'єкта, яке здійснюється у парафіні, целоїдині, синтетичних смолах. Переважна більшість цих речовин з водою не змішується, і тому для просочення ними матеріалу необхідно ретельно видалити воду з тканини, а потім просочити її ксилолом (толуолом, бензолом), тобто речовиною, яка добре розчиняє парафін, а також змішується зі 100-градусним етиловим спиртом. Після просочення об'єкта рідким парафіном при 55...56°С йому дають затверднути при кімнатній температурі разом з парафіном у спеціальних формочках. Так отримують парафіновий блок. Ця процедура називається заливкою. Більш швидке ущільнення досягається шляхом заморожування шматочків тканини сухим льодом (двоокисом вуглецю) або рідким азотом, однак структура досліджуваних гістологічних об'єктів зберігається при цьому гірше.

Ущільнення матеріалу дає змогу виготовити з нього тонкі (завтовшки 5...7 мкм), півтонкі (0,5...1 мкм) зрізи, які використовують для світлової мікроскопії; для електронної мікроскопії вживають ультратонкі зрізи (0,05...0,2 мкм). Виготовлення зрізів проводять на спеціальних приладах — мікротомах (для світлової мікроскопії) і ультрамікротомах (для електронної мікроскопії). Тонкий, півтонкий або ультратонкий зрізи є прозорими для світлових променів або пучка електронів об'єктами і дають можливість вивчення їх під відповідними мікроскопами. Для того щоб розрізняти структурні деталі об'єкта, більшість яких не мають природного контрасту, отриманий зріз треба пофарбувати (для вивчення під світловим мікроскопом) або контрастувати (для електронної мікроскопії).

У гістології існує багато методів забарвлення препаратів і застосовується багато різних барвників залежно від мети дослідження. Гістологічні барвники за походженням поділяють на рослинні, тваринні та синтетичні (анілінові). Прикладом рослинних барвників є гематоксилін, який одержують з кори кампешевого дерева, що росте у Центральній Америці, а тваринних кармін, який отримують з комах — кошенілі. Абсолютна більшість барвників є синтетичними — еозин, фуксин, азур тощо.

Найважливішою є класифікація гістологічних барвників за хімічними властивостями, тому що на ній базується ряд понять і термінів, які далі будуть зустрічатися протягом усього курсу. Отже, за хімічними властивостями гістологічні барвники поділяють на кислі, основні та нейтральні. Властивості кислих барвників визначаються групами —СООН, —НSO₃, — Н₂РО₃, це так звані аніонні барвники. Кислі барвники забарвлюють цитоплазму клітини, їх називають цитоплазматичними. Прикладом таких барвників можуть бути еозин (дає ясно-рожевий колір), ясний зелений (дає зелений колір). Гістологічні структури, що здатні забарвлюватися кислими барвниками, називають оксифільними (ацидофільними, еозинофільними). Це, наприклад, цитоплазматичні гранули еозинофільних лейкоцитів, колагенові волокна тощо.

Основні барвники є катіонними, переважна більшість їх у складі молекули має позитивно заряджені атоми азоту. Вказані барвники вибірково забарвлюють ядра клітин і тому їх називають ядерними. Прикладом можуть бути гематоксилін (забарвлює у синьо-фіолетовий колір), кармін (в ясно-червоний), сафранін (у темно-червоний), азур II (у фіолетовий). Гістологічні структури, що здатні забарвлюватися основними барвниками, називають б а з о ф і л ь н и м и. Це гранули у цитоплазмі базофільних лейкоцитів, ядра клітин тощо.

Нейтральні барвники утворюються при сполученні водних розчинів кислого та основного барвників, наприклад, еозиново-кислий метиленовий синій. Крім того, слід розрізняти нейтральні барвникові суміші, коли у розчині одночасно присутні основний та кислий барвники. Структури, які одночасно сприймають як основні, так і кислі барвники, називають нейтрофільним и, або поліхроматоф і л ь н и м и. Прикладом можуть бути гранули нейтрофільних лейкоцитів, цитоплазма поліхроматофільних еритробластів тощо. Здатність гістологічних структур змінювати колір основного барвника позначається терміном метахромазія. Метахроматично забарвлюється зернистість базофільних лейкоцитів, міжклітинна речовина хрящової тканини тощо. Препарати завжди фарбують сполученням одного кислого й одного основного барвників, що дає змогу виявити ядро, цитоплазму і всі базофільні й оксифільні структури. Одним з найчастіше вживаних сполучень є гематоксилін-еозин.

Крім кислих, основних і нейтральних барвників, існують спеціальні, які використовують для виявлення певних речовин або структур. Наприклад, судан III забарвлює жирові речовини в оранжевий колір, а орсеїн — еластичні волокна в бурий.

Забарвлені препарати звичайно обезводнюють у спиртах, просвітлюють у ксилолі і, заливаючи тонким шаром канадського бальзаму, накривають покривним склом. Після висихання бальзаму отримують постійний препарат, яким можна користуватися протягом довгого часу.

Для електронної мікроскопії зрізи, отримані на ультрамікротомах, розміщують на спеціальних сіточках, контрастують солями урану або свинцю, переглядають через мікроскоп і фотографують. Одержані мікрофотографії є об'єктом вивчення поряд з гістологічними препаратами.

Крім описаних тонких зрізів, є ще інші види гістологічних препаратів, які вживають значно рідше, лише в окремих випадках. До них належать мазки (крові, кісткового мозку, слини тощо), відбитки (печінки, тимусу, слизової оболонки сечового міхура), плівки (сполучної тканини, плеври, очеревини, м'якої мозкової оболонки), тотальні препарати (зародки ранніх стадій розвитку, статеві клітини).

Вітальні (прижиттєві) методи дослідження клітин або тканин дають можливість отримати інформацію про те, як у них відбуваються процеси життєдіяльності, прослідкувати рух, поділ, ріст, взаємодію клітин, їхню реакцію на дію різних факторів. Прижиттєві методи дослідження — необхідне доповнення до тих даних, які одержані методом класичної гістології про будову клітин, тканин. Прижиттєві дослідження проводять в живому організмі, тобто іn VIVO. Для дослідження живих клітин використовують методи вітального та суправітального забарвлення. При цьому застосовують спеціальні, не токсичні для живих тканин, барвники. При вітальному за барвленні барвник вводять в організм живої тварини і він вибірково забарвлює певні клітини. Так досліджують клітини макрофагічної системи при введенні трипанового синього або літієвого карміну. Суправітальне забарвлення — це забарвлення живих клітин, які ізольовані з організму. Так виявляють лізосоми (барвник нейтральний червоний), мітохондрії (янус зелений), ретикулоцити крові (діамант-крезиловий синій).

Для вітального або суправітального, а також поствітального досліджень нефарбованих гістологічних об'єктів використовують ряд спеціальних методів світлової мікроскопії — фазоконтрастну, темнопольову, флюоресцентну.

Метод фазового контрасту забезпечує необхідну контрастність досліджуваних нефарбованих структур за рахунок спеціальної кільцевої діафрагми, що вміщується в конденсор і так званої фазової пластинки, що міститься в об'єктиві. Така конструкція оптики світлового мікроскопа дає змогу перетворювати фазові зміни світла, що проходить через нефарбований об'єкт, в амплітудні, що помічаються оком як зміни яскравості. У результаті можна розрізнити структури, що мають різні показники заломлення.

Метод темнопольової мікроскопі дає змогу бачити нефарбовані (прозорі) структури за рахунок використання спеціального темнопольового конденсора. У результаті на темному тлі видно сріблясті контури об'єктів.

Люмінесцентна (або флуоресцентна) мікроскопія базується на явищі люмінесценції, тобто властивості живих структур світитися при поглинанні променів короткохвильової (ультрафіолетової, фіолетової або синьої) частини спектру. При цьому довжина хвилі флюоресценції завжди більша від довжини хвилі збуджуючого світла. Усім живим клітинам властива флюоресценція, яка має назву власної, або первинної. Вона є слабкою, і тому частіше використовують так звану вторинну флюоресценцію, коли об'єкти попередньо обробляють спеціальними барвниками — флюорохромами. З останніх найчастіше вживають акридин оранжевий. При його використанні ядра клітин, що містять ДНК, дають яскраво-зелене світіння, а цитоплазма внаслідок наявності РНК — яскраво-червоне.

За останні десятиліття значного поширення набули методи гістохімії, авторадіографії, імуноморфології, цитоспектро-фотометрії. Гістохімічний метод дає можливість визначити локалізацію тих чи інших хімічних речовин у різних структурних компонентах клітин і тканин. При гістохімічних дослідженнях речовини, що входять до складу клітин, реагують з хімічними реактивами і утворюють забарвлені продукти реакції, за якими можна визначити як локалізацію, так і до деякої міри, кількісний вміст речовин у тих чи інших структурах.

В основі авторадіографічного методу лежить використання радіоактивних ізотопів і мічених ними сполук. Такі сполуки вводять в організм піддослідної тварини, а потім радіоактивні речовини виявляють у гістологічних зрізах за допомогою фотоемульсії, якою вкривають препарат і проявляють. У тих місцях, де фотоемульсія контактує з радіоактивною речовиною, лишаються засвічені ділянки — треки. Цим методом можна досліджувати обмін йоду в щитовидній залозі, утворення нуклеїнових кислот, білків тощо.

Імуногістохімічні методи базуються на реакціях антиген-антитіло. Кожна клітина організму має специфічний антигенний склад, який визначається, здебільшого білками. Шляхом імунізації можна отримати відповідні антигенам специфічні антитіла. Антитіла зв'язують з флюорохромами або ферментами. Після обробки досліджуваних гістологічних препаратів у місцях локалізації відповідних антигенів концентруються молекули мічених антитіл, які виявляють або завдяки світінню (люмінесцентна мікроскопія), або на основі відкладання забарвлених продуктів гістохімічної реакції (світлова мікроскопія). Цим методом теоретично можна ідентифікувати будь-які клітини або речовини, продуковані тими чи іншими клітинами, наприклад, гормони, на які здійснюється вироблення антитіл.

Цитоспектрофотом е т р і я — метод кількісного вимірювання вмісту різних речовин у клітині на основі вивчення спектрів поглинання ними світлових променів. Метод проточної цитометрії дає змогу аналізувати характеристики клітин у суспензії, які перетинають сфокусований лазерний промінь. Відповідний прилад має назву цитофлюорографа. За допомогою цього методу можна визначати розміри і форму клітин, їх життєздатність, розділяти клітини вихідної суспензії на субпопуляції.

Великим кроком вперед у розвитку техніки мікроскопічних досліджень було створення і застосування електронного мікроскопа, винахідником якого був Емст Руска (1906—1988). В електронному мікроскопі для «освітлення» об'єкта використовується потік електронів, який має набагато коротшу довжину хвилі порівняно з видимим світлом, яке використовується у світловому мікроскопі. Завдяки цьому, роздільна відстань, яка становить 1/3 довжини хвилі, при якій проводять мікроскопію, для світлового мікроскопа дорівнює 0,2 мкм (теоретично), тоді як для електронного мікроскопа теоретично розрахована роздільна відстань — 0,002 нм. Практично у кращих електронних мікроскопах роздільна відстань становить 0,1—0,7 нм.

Роздільна відстань або роздільна здатність мікроскопа — це мінімальна відстань між двома точками на гістологічному препараті, які за допомогою мікроскопа можна розрізнити як дві окремі точки, що не зливаються. Роздільна відстань свідчить про найменші розміри структур, які можна розглянути за допомогою даного мікроскопа. На основі роздільної відстані світлового мікроскопа роблять умовний поділ структур на мікроскопічні, тобто більші за 0,2 мкм, і субмікроскопічні — менші за 0,2 мкм. Останні можна побачити лише під електронним мікроскопом.

Зараз у дослідницькій роботі все ширше використовуються с к а н у ю ч і (або растрові) е л е к т р о н н і м і к р о с к о п и які дають тривимірні (об'ємні) зображення об'єкта. Важливими позитивними якостями цього виду мікроскопії є велика глибина різкості (у 100—1000 разів більша, ніж у світлового мікроскопа), широкий діапазон зміни збільшення (від 10 до десятків тисяч разів) і висока роздільна здатність.

Поняття про артефакт.У процесі підготовки об'єкта для дослідження під мікроскопом, незважаючи на намагання не змінювати прижиттєвого вигляду досліджуваного матеріалу, зміни у ньому, хоча й мінімальні, можуть виникати. Штучний утвір, що з'являється в об'єкті при підготовці його для дослідження і може бути причиною отримання хибних результатів, одержав назву а р т е ф а к т у (від латинського «агіегасини» штучно зроблене). При гістологічному дослідженні артефакти можуть бути грубими і досить простими, які легко розпізнаються, однак можуть бути і такими, розпізнати які може лише досвідчений гістолог. Прикладом простих артефактів є пухирці повітря, що потрапляють у препарат при накриванні його покривним скельцем, або волокна тканини, якою протирають це скельце перед накриванням. Це може бути також осад фарби у препараті, який хтось помилково вважатиме ядром, слід від зазубрини мікротомного ножа та інші. Більш складними артефактами є зміна форми клітин, а також виникнення порожнин, щілин між певними шарами органів внаслідок стискання тканини при фіксації, обезводненні тощо.

Терміни для запам'ятовування

1. Гістологія. 2. Цитологія. 3. Загальна гістологія. 4. Спеціальна гістологія. 5. Ембріологія. 6. Тонкі (мікроскопічні) структури. 7. Ультратонкі (субмікроскопічні) структури. 8. Мікроскопічний метод. 9. Гістологічна (мікроскопічна) техніка. 10. Вітальні (суправітальні) методи. 11. Поствітальні методи. 12. Постійний гістологічний препарат. 13. Взяття матеріалу. 14. Фіксація. 15. Обезводнення. 16. Ущільнення. 17. Заливка. 18. Мікротом. 19. Ультрамікротом. 20. Гістологічний зріз. 21. Забарвлення зрізу. 22. Контрастування зрізу. 23. Гістологічні барвники. 24. Гематоксилін. 25. Еозин. 26. Оксифілія (еозинофілія, ацидофілія). 27. Базофілія. 28. Нейтрофілія. 29. Поліхроматофілія. 30. Метахромазія. 31. Вітальне (суправітальне) забарвлення. 32. Трипановий синій. 33. Фазоконтрастна мікроскопія. 34. Темнопольова мікроскопія. 35. Люмінесцентна мікроскопія. 36. Гістохімія. 37. Авторадіографія. 38. Імуноморфологія. 39. Цитоспектрофотометрія. 40. Проточна цитометрія. 41. Світлова мікроскопія. 42. Електронна мікроскопія. 43. Роздільна відстань (здатність) мікроскопи. 44. Скануюча (растрова) електронна мікроскопія. 45. Артефакті.