Ініціація транскрипції

Зрозуміло, що РНК-полімераза може бути орієнтована відносно ДНК двома способами: кожній із цих орієнтацій буде відповідати два можливі напрямки руху ферменту при транскрипції. Відповідно, один із двох ланцюгів ДНК буде обиратися як матричний – той, з якого зчитується інформація в напрямку 3′ → 5′ – і на якому синтезується комплементарний ланцюг РНК у протилежному напрямку 5′ → 3′ (рис. 6).

Послідовність ланцюга ДНК, який є комплементарним матричному, збігається з послідовністю РНК, що синтезується. Тому саме цей нематричний ланцюг називають кодуючим або змістовним, і саме його послідовність прийнято наводити як послідовність даного гена (матричний ланцюг називають, відповідно, антикодуючим). Нуклеотид кодуючого ланцюга, який відповідає стартовому нуклеотиду РНК (частіше пуриновий), позначається як +1, наступні нуклеотиди (чи пари основ) у напрямку руху полімерази нумерують із позначкою «+»: +2, +3 і т.д. У зворотному напрямку (ліворуч на рис. 6) нуклеотиди нумерують із позначкою «–» (починаючи з –1).

Рис. 6. Типовий промотор E. coli. Зелена стрілка позначає старт транскрипції всередині розплавленої зони.

Типовий бактеріальний промотор (рис 6) складається із двох елементів послідовності, які знаходяться на відстані приблизно –10 і –35 від стартової точки. Консенсусна (узагальнена для різних промоторів) послідовність елемента –35 має вигляд T₈₂T₈₄G₇₈A₆₅C₅₄A₄₅ (числами позначено частоту даної пари основ у відсотках). Послідовність елемента –10 (називається також боксом Прибноу (David Pribnow) – Pribnowbox): T₈₀A₉₅T₄₅A₆₀A₅₀T₉₆. Варіабельність послідовностей визначає різну ефективність ініціації – силу промоторів. Саме елементи –35 і –10 безпосередньо впізнаються σ-фактором при ініціації транскрипції.

Наведені послідовності впізнаються варіантом σ-фактора з молекулярною вагою 70 кДа (σ70), який є досить широко вживаним, але не єдиним. Кільком іншим варіантам σ, під контролем яких знаходяться певні групи промоторів, відповідають інші консенсусні послідовності –35 та –10. Взаємодія σ-фактора з промотором чітко орієнтує РНК-полімеразу відносно ДНК, тобто визначає і стартову точку транскрипції, і її напрямок (вибір одного з двох ланцюгів як матричного). Вважається, що субодиниця σ утримує щелепи у відкритому положенні у складі голоферменту. Це сприяє підвищенню швидкості дисоціації білка від непромоторної ДНК і гарантує низьку ефективність транскрипції з випадкових сайтів на ДНК (рис. 7). За умови впізнання σ-фактором двох елементів промотора відбувається структурна перебудова полімеразного комплексу із замиканням щелеп. У результаті ДНК у зоні пари основ +1 потрапляє всередину щілини між щелепами – утворюється закритий комплекс.

Дуже швидко закритий комплекс перетворюється на відкритий: замикання ДНК у щілині приводить до того, що подвійна спіраль не може розміститися там за недостатністю простору. У результаті відбувається локальне плавлення 12 – 14 пар основ (формування транскрипційного міхура) у зоні від –7 до +5 відносно стартової точки (рис. 6, 7). Важливим фактором, що сприяє локальному плавленню подвійної спіралі у складі відкритого комплексу, є наявність у циркулярній бактеріальній ДНК певного рівня негативної надспіралізації напружень, що полегшують розкручування дуплекса.

Рис. 7. Послідовність подій при ініціації транскрипції.

Плавлення ДНК у щілині РНК-полімерази відбувається за рахунок взаємодії двох ланцюгів із внутрішньою поверхнею щілини: нематричний ланцюг захоплюється певними структурними елементами полімерази, матричний – опиняється в активному центрі. За активним центром ДНК робить вигин майже під прямим кутом відносно ДНК, що лежить нижче від активного центру.

Наступна, найповільніша стадія ініціації – синтез першого фосфодіефірного зв’язку, тобто ініціація власне синтезу РНК. Здатність ініціювати синтез нуклеїнової кислоти – унікальна властивість РНК-полімерази (ДНК-полімераза здатна лише продовжувати синтез уже існуючого ланцюга). Ініціація синтезу є дуже важкою, оскільки при цьому дві порівняно невеликі молекули – перші два нуклеотиди – мають бути жорстко зафіксовані в активному центрі в певній геометрії. Така фіксація залежить від взаємодій σ-фактора з активним центром: певною мірою субодиниця σ відіграє роль 3′-кінцевої ділянки РНК, яка бере участь у створенні сайта зв’язування чергового нуклеотиду при елонгації (див. нижче), але якої ще не існує при ініціації.

Далі процес нарощування транскрипту продовжується ще до восьми–дев’яти нуклеотидів, які можуть розміститися в межах РНК-полімеразного комплексу до виходу в спеціальний канал. У процесі зростання цього первинного транскрипту можливе його визволення – абортивна ініціація. Узагалі, оточення активного центру РНК-полімерази має високу спорідненість до тимчасового РНК-ДНК-гібрида, що існує під час транскрипції (див. рис. 4). Але чим коротшим є гібрид, тим менше взаємодій він реалізує з полімеразою, і тим менш стабільним він є. Додаткова стабілізація короткого гібрида здійснюється завдяки взаємодії з ним σ-фактора.

Друга причина абортивної ініціації – конкуренція між σ-фактором і РНК за канал виходу. У принципі, після зростання транскрипту до 9 – 10 нуклеотидів σ-фактор більше не потрібен – він зробив свою справу. Можливий програш з боку РНК конкуренції за канал є своєрідною платою за можливість ініціювати синтез першого зв’язку. У разі такого програшу голофермент може повторити свою спробу ініціювати транскрипцію. Якщо ж конкуренцію виграє РНК, σ-фактор (після синтезу близько 12 нуклеотидів) нарешті витісняється з комплексу (відбувається очищення промотора) і розпочинається елонгація транскрипції.