Занятие № 11.
ТЕМА. МИКРОСОМАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ.
КОМПОНЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ. ОПРЕ-
ДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ.
Цель занятия: 1.Получить представления об особенностях микросомального окисления, компонентах монооксигеназной цепи, биологическом значении гидроксилирования субстратов, антиоксидантах.
2.Овладеть методикой определения фермента каталазы.
Исходный уровень знаний:
- анаболизм и катаболизм как две стороны единого процесса
обмена веществ;
- представления о окислительном фосфорилировании;
- строение клетки, микросомы;
- оксидоредуктазы.
Содержание занятия.
I.2. Состав микросомной фракции, выделяемой из клеток.
Особенности строения монооксигеназ (гидроксилаз).
Роль микросомального окисления в метаболизме регуляторных молекул, ксенобиотиков.
Антиоксидантная роль витаминов С и Е.
Понятие о пероксисомальном окислении.
Роль пероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы.
II.1.Работа № 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА КАТАЛАЗУ
Фермент каталаза относится к классу оксидоредуктаз. Этот фермент содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много его в строме эритроцитов и печени. Биологическая роль каталазы заключается в разложении вредной для организма перекиси водорода на молекулярный кислород и воду.
2H2O2 2H2O + O2
каталаза
Принцип метода.
Фермент каталаза содержит гем. В процессе разрушения перекиси водорода происходит окисление и восстановление железа, входящего в состав фермента.
Порядок выполнения работы:
| Реактивы | Контрольная пробирка | Опытная пробирка |
| Н2О (мл) | ||
| Кровь (кап) | ||
| Кипятить 2-3 мин, затем охладить | ||
| 3% раствор Н2О2 (кап) | 5-10 | 5-10 |
| Встряхнуть | ||
| РЕЗУЛЬТАТЫ: |
Работа № 2.КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
КАТАЛАЗЫ (ПО БАХУ И ЗУБКОВОЙ).
Принцип метода. В основе количественного определения каталазы лежит определение количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток времени, по следующему уравнению:
2KMnO4+5H2O2+4H2SO4 2MnSO4+8H2O+5O2+2KHSO4
Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа. Каталазным числом (КЧ) называют количество миллиграммов Н2О2, которое разлагается в 1 мкл крови. О количестве расщепленной Н2О2 судят по разности объема раствора KMnO4, израсходованного до и после действия каталазы.
Порядок выполнения работы:
Приготовление раствора крови. В мерную колбу вместимостью 100 мл налить около 10 мл дистиллированной Н2О, затем внести микропипеткой 0,1 мл крови. Микропипетку промыть три раза водой из колбы. Долить водой до метки, чтобы кровь была разведена в 1000 раз (1 мл раствора содержит 1 мкл крови)
| Реактивы (мл) | Опытная колба | Контрольная колба |
| Н2О | ||
| Кровь, разведенная 1:1000 | ||
| 1% раствор Н2О2 | - | |
| 10% раствор Н2SO4 | - | |
| Примечание. Действие каталазы прекращается в кислой среде, т.к. она действует при рН 7,4 Инкубация 30 минут при комнатной температуре | ||
| 10% раствор H2SO4 | - | |
| 1% раствор Н2О2 | - |
Титрование 0,1 N раствором KMnO4 до розовой окраски.
КЧ = (А - В) ∙ 1,7
где: А - количество мл 0,1 N р-ра KMnO4, пошедшее на титрование контрольной пробы;
В - количество мл 0,1 N р-ра KMnO4, пошедшее на титрование опытной пробы.
Полученную разность умножают на 1,7 (1 мл 0,1 N раствора KMnO4 эквивалентен 1 мл 0,1 N Н2О2, в котором содержится 1,7 ммоль/л (1,7 мг) Н2О2, т.к. 1 моль/л Н2О2 равен 1,7 г.)
Клинико-диагностическое значение.
В норме каталазное число составляет 10-15 ед. При раке, анемии, туберкулезе содержание каталазы в крови снижается.
| РЕЗУЛЬТАТЫ: | А = | В = |
| КЧ = |
ВЫВОД:
III.2. Контрольные вопросы.
К какому классу ферментов относятся каталаза и пероксидаза?
В каких клетках наибольшее количество каталазы?
Какой субстрат является специфическим для каталазы?
Что такое каталазное число?
Чему в норме равно каталазное число?
Укажите диагностическое значение количественного определения каталазы крови.
Материал для самоподготовки: I а)1. с.313–318, 559
595-596; II; III.
Дата добавления: 2015-09-11; просмотров: 1332;