Получение и культивирование каллуса

1 Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности. Изолированные от растения фрагменты (экспланты), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными инструментами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изолированных тканей. Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фольгу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160 ^о С в течение 1,5-2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 ^о С и давлении 0,75- 1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 ^о С.

Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому проводится поверхностная стерилизация. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант, промывают водой с мылом, споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. Время стерилизации зависит от объекта, стерилизующего материала. По Бутенко Р.Г. сухие семена в среднем – время стерилизации 10-20 минут, семена набухшие – 6-10 минут, листья – 3-5 минут.

После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем растворе несколько раз промывают в дистиллированной воде и скальпелем удаляют наружные слои клеток на срезах эксплантов, так как он может быть поврежден при стерилизации.

Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной ткани. Поэтому, кроме поверхностной стерилизации иногда приходится применять антибиотики, которые и убивают микробы внутри ткани. Следует, однако, заметить, что подобная обработка не всегда приводит к стерилизации внутренних тканей, так как трудно выбрать направленно действующий антибиотик.

На рост и развитие растительных тканей in vitro большое влияние оказывают физические факторы – свет, температура, аэрация, влажность.

Свет.Большинство каллусных тканей могут расти в условиях сильного освещения или в темноте, так как они не способны фотосинтезировать. Вместе с тем свет может выступать как фактор, обеспечивающий морфогенез и активирующий процесс вторичного синтеза. В качестве источника света используют люминесцентные лампы. Для большинства растений оптимум освещенности составляет примерно 1000 люкс. Кроме интенсивности освещенности на культуру ткани и ее физиологические особенности влияет качество света.

Температура. Для большинства каллусных культур оптимальна температура 26 ^о С. Аэрация. Для выращивания суспензионных культур большое значение имеет аэрация. Особенно важно снабжение воздухом культивируемых клеток в больших объемах ферментеров.

При выращивании клеток в малых объемах (в колбах) нормальная аэрация достигается при постоянном перемешивании суспензии.

Влажность.Оптимальная влажность в помещении, где растут культуры, должна составлять 60-70 %.

2 Каллус – ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток. Пролиферация – это новообразование клеток и тканей путем размножения уже существующих. Каллус (от лат. callus – «толстая кожа», «мозоль») – особый тип ткани, образующийся на целом растении в результате его ранения. Он защищает место травмы, накапливает питательные вещества и способствует регенерации специального защитного слоя или утраченного органа. Подобные клетки возникают и в культуре клеток и тканей. Фрагмент ткани или органа, так называемый эксплант, помещенный на подходящую по составу питательную среду, через некоторое время начинает расти и превращается в массу недифференцированных клеток – каллус. Этот процесс называется каллусообразованием, или каллусогенезом.

Специализированные неделящиеся клетки возобновляют клеточные деления, то есть вновь возвращаются к меристематическому состоянию. Переход специализированных неделящихся клеток к пролиферации называется дедифференциацией. Дифференциация - это комплекс процессов, приводящих к различиям между материнскими и дочерними клетками, а также между дочерними клетками. В результате дифференциации клетки, казавшиеся до того сходными, приобретают морфологические различия и начинают выполнять разные физиологические функции. При дедифференциации и образовании каллуса наблюдается обратное: клетки теряют структуры, характерные для их специфических функций, и возвращаются к состоянию делящейся клетки, т.е. они как бы обезличиваются, становятся одинаковыми.

Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом на агаре, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющих строго определенной анатомической структуры. Она не имеет четко выраженной структуры, но может различаться по плотности. Происхождение и условия выращивания определяют, будет ли каллусная ткань рыхлой, средней плотности или плотной.

Таблица 1