Гібридоми

Цікаво, що шляхом соматичної гібридизації утворюються гібриди між раковими і нормальними клітинами. Це застосовується для одержання гібридом – продуктів злиття лімфоцитів і пухлинних клітин кісткового мозку. Гібридоми продукують моноклональні антитіла. Цю особливість вони успадковують від певного клону лімфоцитів. Разом з цим гібридоми здатні до необмеженого поділу на поживному середовищі. Ця властивість потенційного безсмертя одержана ними від пухлинних клітин. Моноклональні антитіла здатні розпізнавати різні типи макромолекул та їхні індиівдуальні особливості. Вони мають значні переваги над звичайними сиворотками, оскільки реагують з певною органічною субстанцією і використовують для діагностики і лікування захворювань.

В.А. Енгельгардт вважає, що є всі можливості виробляти антитіла, спрямовані проти одного конкретного індивідуального білка. Ці клітини (гібридоми) успішно розвиваються поза організмом, в культурі in vitro, і завдяки цьому можна одержувати значну кількість ідеальних чистих антитіл. Гібридоми – ідеальні інструменти діагностики багатьох хвороб, особливо раку.

6. Роль ядра в спадковості. Трансплантація ядер. Клонування.

Ядра мають усі еукаріотичні клітини, за винятком зрілих члеників ситовидних трубок флоеми і зрілих еритроцитів ссавців. З усіх органоїдів ядра найпомітніші, і тому вони були описані першими серед клітинних структур у 1825—1839 pp.

Ядро— інформаційний центр клітини, у якому зосереджена основна частина генетичної інформації у формі ДНК. Воно виконує три основні функції. 1. Зберігає інформацію; 2. Передає її у цитоплазму; 3. Відтворює генетичну інформацію і рівномірно розподіляє її між дочірніми клітинами в процесі їх авторепродукції.

Матеріальний зв'язок між поколіннями у разі статевого розмноження здійснюється гаметами. Зливаючись, вони дають початок зиготі, з якої шляхом мітотичних поділів і диференціації клітин виникає цілісний організм з характерними для нього ознаками. Чоловічі та жіночі гамети істотно відрізняються за формою, розмірами та вмістом цитоплазми, але вони рівнозначні за ядрами. У зрілому сперматозооні ядро, яке розміщене в головці, ущільнене. Коли сперматозоон проникає в яйцеклітину, його ядро розрихлюється і стає подібним до ядра жіночої гамети. Інформаційний (ядерний) внесок у зиготу сперматозоона і яйцеклітини є однаковим (п + n хромосом).

Ядру в явищах спадковості належить вирішальна роль, але абсолютизувати її все ж не слід. Спадковість є властивістю живої системи (клітини, організму), а не її окремого компонента. Морфофункціональна єдність клітини забезпечується взаємодією ядра і цитоплазми. В ядро з цитоплазми надходять речовини регуляторної природи, які впливають на активність генів, а також попередники і ферменти, необхідні для реплікації ДНК, синтезу РНК, побудови хромосом та інших структур. З ядра у цитоплазму надходять продукти генної активності (іРНК), які забезпечують синтез специфічних білків.

Отже, ядро керує всіма білковими синтезами і через них біохімічними, фізіологічними і морфологічними процесами в клітині, а цитоплазма за принципом зворотного зв'язку регулює активність генетичного апарату ядра і забезпечує його матеріалами і енергією. Ядерно-цитоплазматична взаємодія ускладнюється тим, що в ній, крім ядра, беруть участь інші ДНК-вмісні структури — мітохондрії і пластиди.

Докази ядерної детермінації ознак отримані під час дослідів по трансплантації ядер (лат. transplantatio — пересаджування), одержанню андрогенних особин та клонуванню генотипів.

Зручним об'єктом для трансплантації окремих частин і ядер виявилася одноклітинна водорость теплих морів ацетабулярія. Її клітина і ядро мають великі розміри (5 см і 0,1 мм). Молода водорость, яка утворюється з зиготи, спочатку має лише ризоїд і ніжку, на якій пізніше утворюється шляпка. Вона складається з численних мішкоподібних вмістилищ — цист, які існують для розмноження. До утворення цист в ацетабулярії є лише одне ядро, яке розміщене в ризоїді. Два види ацетабулярії — Acetabularia mediterranea і A. wettsteinii — відрізняються за формою шляпки (перший вид має велику парасолькоподібну шляпку). Якщо без'ядерний відрізок ніжки A. mediterranea щепити з ризоїдом A. wettsteinii, компоненти зростуться і відрізок ніжки одного виду (A. mediterranea) регенерує шляпку іншого виду (A. wettsteinii). Це свідчить проте, що контроль за формою шляпки здійснюється ядром.

Якщо з молодої водорості одного виду, яка ще не утворила шляпку, вилучити її власне ядро і перенести в ризоїд ядра іншого виду, то такий ядерно-плазматичний гібрид утворить типову для донора ядра шляпку. Перенесення в одну клітину ацетабулярії ядер різних видів призводить до утворення шляпки з проміжною формою.

Переконливим доказом ядерної детермінації окремих ознак є досліди Б. Л. Астаурова з шовкопрядами. Для шовкопряда властиве явище фізіологічної поліспермії — проникнення в яйце під час запліднення багатьох сперматозоонів. У цитоплазмі яйцеклітини головки всіх сперматозоонів перетворюються у чоловічі пронуклеуси. Один з них з'єднується з жіночим ядром, утворюючи ядро зиготи, а інші дегенерують.

Ядро яйця, на відміну від цитоплазми, дуже чутливе до температурних впливів і радіації. Тому температурним шоком і опроміненням можна зруйнувати ядро яйцеклітини, не викликавши необоротних змін у цитоплазмі. Якщо яйцеклітини із зруйнованим ядром запліднити, два чоловічі пронуклеуси зливаються і виникає зигота, яка має цитоплазму материнської форми (ВВ), аядро (2п) — батьківської (bb). Особини, які розвиваються на основі ядра батьківської форми і цитоплазми яйцеклітини, називають андрогенними (рис. 9). Вони копіюють батьківську форму (донора ядра) за багатьма ознаками, зокрема за статтю і забарвленням гусені. У андрогенних особин виявилася рецесивна ознака білого забарвлення. Це свідчить, що її детермінат знаходиться в ядрі, одержаному від батька.

Руйнуючи таким чином ядра яйцеклітин мандаринового шовкопряда і запліднюючи їх сперматозоонами шовковичного шовкопряда, Б. Л. Астауров одержав потомство, яке копіювало батьківську форму за багатьма ознаками.

Значний інтерес викликає проблема копіювання генотипів у вищих форм. Ідея копіювання полягає в тому, щоб виключити з яйцеклітин їх власні ядра і ввести замість них диплоїдні ядра збажаним для експериментатора генотипом. Якщо такі гібридні яйцеклітини розвиватимуться, можна буде одержати клон — сукупність організмів, які виникають від одного предка шляхом безстатевого розмноження. Особини певного клону мають однаковий генотип. Користуючись відповідними методами, можна добути з матки ссавців (і навіть людини) незапліднені яйцеклітини і запліднити їх in vitro. Запліднені таким чином яйця імплантуються в матку матері або «нерідної матері» і дають початок ембріону. Цей підхід був використаний у 1981 р. К. Ілменсі і П. Хопе для одержання клонів мишей.

Природним доказом генетичної рівноцінності клітин, що виникають шляхом мітозу, є однояйцеві близнюки. Вони утворюються з однієї зиготи, яка зазнає мітотичного поділу. Утворені клітини відокремлюються і дають початок двом або кільком ембріонам. Отже, тут маємо безстатеве розмноження. Такі близнюки внаслідок ідентичності генетичної програми (ДНК) мають однакові білки, і імунологічної несумісності під час трансплантації тканин і органів у них не спостерігається. Обмін речовин відбувається однотипне, що й забезпечує високу морфологічну подібність їх

Чимало видів рослин, тварин і мікроорганізмів розмножуються безстатевим шляхом за допомогою мітотичного поділу клітин. Сукупність клітин або особин, які виникли від спільного предка шляхом безстатевого розмноження, називають клоном. Прикладами клонів можуть бути: однояйцеві близнюки, окремі колонії мікроорганізмів, сорти рослин, які розмножуються вегетативно. Клони характеризуються високою генетичною стабільністю потомства навіть у разі гетерозиготності вихідного предка.

Більшість сортів плодових і всі сорти картоплі є клонами, тобто вегетативним потомством однієї рослини, відібраної селекціонером. І тому, коли ми щеплюємо Кальвіль сніговий з будь-якою підщепою, дичкою або культурним сортом, то завжди впевнені в тому, що в майбутньому матимемо типові для цього сорту яблука, незважаючи на фізіологічний взаємовплив компонентів.

Слід зауважити, що ріст рослин і тварин зумовлюється мітотичним поділом клітин і їх ростом. Усі клітини певного організму, наприклад людини, належать до одного клону.

Клітина, яка здатна реалізувати генетичну інформацію дати початок усім типам тканин і цілому організму, назиється тотипотентною. Прикладом такої клітини може бути зигота.

Біологів здавна цікавило питання про те, до якого часу в ході диференціації клітин зберігається ця властивість. Розділяючи ранні зародки амфібій на окремі клітини, дослідники переконалися в тому, що клітини певний час залишаються тотипотентними. Природним доказом тотіпотентності клітин раннього зародка є народження ідентичних близнюків у людини (кожна з 2—4 клітин у разі їх спонтанного роз'єднання може дати початок нормальному ембріону). У 8-клітинному зародку кролика можна вбити голкою 7 клітин і лише з однієї одержати нормальну тваринy.

Ще в 1902 р. німецький ботанік Г. Габерланд вперше вловив думку про те, що всі живі рослинні клітини тотирантні. Він вважав, що шматочок рослинної тканини і навіть окрема клітина здатні утворити цілу рослину, але він не зміг цього здійснити, оскільки на той час вчені не знали як культивувати рослинні клітини in vitro і які речовини слід додати до культурального середовища, щоб примусити калусну тканину диференціюватися.

Для вивчення питання тотипотентності клітинних ядер у ході диференціації американські вчені Р. Бріггс і Т. Кінг у 1952 р. розробили метод трансплантації ядер у без'ядерні (енуклейовані) яйцеклітини жаби. При цьому ядро яйцеклітини вилучають тонкою голкою, а скляною мікропіпеткою вносять ядро однієї з клітин раннього зародка. Ядра клітин, взяті із зародка на стадії бластули, у 80 % випадків забезпечували нормальний розвиток. Під час трансплантації ядер з клітин зародка, який перебував на стадії гаструли, нормальний розвиток спостерігався лише в 20 % випадків. Якщо ж використовувались ядра клітин зародка, в якому почав формуватись зачаток центральної нервової системи, то в жодному з випадків не спостерігалось утворення нормальних зародків. Ці факти свідчили про стабільну інактивацію багатьох генів у ході диференціації клітин, адже цитоплазма яйця не змогла активувати ті гени, які забезпечують нормальний розвиток.

Цікаві досліди з трансплантації ядер у південно-африканської жаби (Xenopus laevis) провів англійський дослідник Д. Гордон. В енуклейовані (шляхом опромінення ультрафіолетом) яйцеклітини він переніс ядра, які були взяті з епітелію кишок пуголовка. З'ясувалося, що 1% яицеклітин з пересадженими ядрами розвивалися нормально і дали початок статевозрілим особинам

Цей дослід засвідчив, що високоспеціалізована клітина Хenopus містить усі гени, потрібні для проходження онтогенезу. Прояв генів пересадженого ядра змінюється; цитоплазма яйця репрограмує діяльність ядра, переводить з диференційованого в початковий стан.

Можливість репрограмування ядра цитоплазмою була ще раз експериментально доведена Е. Робертисом та Д. Гордоном. Вони вводили в овоцити тритона безліч ядер клітин нирок південноафриканської жаби. Застосовуючи двомірну хроматографію в гелі та мічені амінокислоти, дослідники показали, що в овоцитах тритона синтезуються білки, характерні для овоциту жаби. Ці білки не синтезувалися в клітинах нирок. Разом з цим специфічні для нирок гени не проявляли своєї активності.

Рослинні клітини здатні до повторної диференціації. Будь-яка жива рослинна клітина може реалізувати генетичну інформацію і дати початок усім типам тканин і цілому рослинному організму.

Цю думку, висловлену вперше Г. Габерландтом, було підтверджено Ф. Стюардом в 1950р. Він ізолював маленький шматок флоеми кореня моркви і вмістив його в рідке культуральне середовище у колбу, яка оберталася. В середовищі була сахароза, фізіологічно необхідні елементи і окремі вітаміни. Однак для росту і диференціації потрібні були ще якісь речовини. Ф. Стюард виявив їх у кокосовому молоці. Під час його додавання клітини, які відокремлювалися від ростучої клітинної маси, після перенесення їх на агаризоване середовище ділилися і в окремих випадках утворювали пагони. Цей експеримент засвідчив, що флоемні клітини містять всю генетичну інформацію, потрібну для розвитку типової рослини цього виду. За наявності відповідних сигналів, які надходять з навколишнього середовища, у ізольованих клітинах «включаються» гени, які не екс-пресувалися в клітинах флоеми.

У культурі ізольованих клітин і тканин можна одержати цілу рослину з клітин пелюстки квітки, пиляка, мікроспори, в'язальця пиляка, флоеми, паренхімних клітин бульби картоплі, серцевини стебла тощо. Тотипотентність є цікавою властивістю рослинних клітин.

Високоспеціалізовані тканини і клітини різних органів рослини під час вміщення їх на штучне поживне середовище, яке містить мінеральні солі, цукри, а також речовини регуляторної природи, зазнають дедиференціації (втрачають свою спеціалізацію) і починаюсь анархічно і неорганізовано розмножуватися. Внаслідок цього виникає так звана калусна тканина. Калус становить собою масу недиференційованих клітин, які утворюються під час поранення і культивування in vitro. Обов'язковою умовою дедиференціації клітин і перетворення їх у калусну тканину є наявність у поживному середовищі фітогормонів (кінетину і ауксину), які відіграють важливу роль у процесі онтогенезу. У культурі калусних тканин при відповідному співвідношенні регуляторних речовин може бути експериментально реалізована потенція всіх типів морфогенезу. При цьому можуть виникати сформовані заново корені, пагони, листки і квітки. Калусна клітина може дати початок соматичному зародку (ембріоїду), який перетворюється потім у цілу рослину, яка здатна цвісти і давати потомство. Цей процес називають соматичним ембріогенезом.

Отже, калусні клітини за своїми потенціями проходження нормального онтогенезу еквівалентні зиготі. Калусна тканина може виникати з будь-якої клітини, яка не втратила ядро і цитоплазму. Звідси ми робимо висновок про те, що всі рослинні клітини тотипотентні і кожна з них може ти будь-якою іншою рослинною клітиною під час наступної диференціації.

Однак умови, які викликають диференціацію калусних тканин і призводять до утворення ембріоїдів, відомі ще не для всіх видів рослин. Проте ці невдачі не є спростуванням тотипотентності рослинних клітин. Вони свідчать лише про те, що ми ще не знаємо умов, потрібних для індукції сомачного ембріогенезу даного виду.

Здатність до соматичного ембріогенезу властива також губкам, кишковопорожнинним і червам.

Клітини ссавців культивуються важко, а примусити їх диференціюватися ще важче, оскільки вони високоспеціалізовані. Рівень складності, який був досягнутий внаслідок диференціації, буває таким високим, наприклад у нейронів, що перешкоджає навіть росту і поділу клітин. Хоча в ядрах диференційованих клітин зберігається генетичний матеріал, більша його частина залишається репресованою і активувати його, здебільшого, не вдається.

Наприкінці ХХ ст. спеціалістти Рослінського інституту (Шотландія) повідомили про вівцю Доллі, що з’явилася на світ завдяки трансплантації ядер. Доктор Кемпбел з клітин грудної залози вагітної 6-річної вівці добували ядра і переміщували їх в енуклейовані яйцеклітини інших овець. Було проведено 400 таких маніпуляцій і лише в 1 випадку (з 400) народилася Доллі, генотип якої був ідентичний генотипу вівці-донора ядра.