Persing D. H., T. F. Smith, F. C. Tenover, T. J. White

(ed.). 1993. Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications. Ametican Society for Microbiology, Washington, D.C.

Plikaytis В. В., R. H. Gelber, T.M. Shinnick. 1990. Rapid and sensitive detection of Mycohacterium leprae using a nested-prime r gene amplification assay. /. Clin. Microbiol. 28: 1913-1917.

Pollard-Knigth D., A. C.Simmonds, A. P. Schaap, H. Akhavan, M. A. W. Brady.1990. Nonradio-active DNA detection on Southern blots by en/y-matically triggered chemiluminescence. Anal. Biochem. 185:353-358.

Etafalski J. A., S. V. Tingey.1993. Genetic diagnostics in plant breeding: RAPDs, microsatellites and machines. Trends Genet. 9: 275-279.

Saiki R. K., P. S, Walsh, C. H. Levenson, H. A. Fjlich.1989. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Nail. Acad. Sei. USA 86:6230-6234.

Sayler G.S., A. C. Layton.1990. Environmental application of nucleic acid hybridization. Anna. Rev, Microbiol. 44:625-648.

Tyagi S., F.R. Κramer. 1996. Molecular beacons: probes that fluorescence upon hybridization. Nat. Bwtechnol. 14:303-308.

Waldmann T. A. 1991. Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy. Science 252: 1657—1662.

Weiss J. B.1995. DNA probes and PCR for diagnosis of parasitic infections. Clin. Microbiol. Rev. 8: 113-130.

White T. J., N. Arnheim, H. A. Erlich.1989. The polymerase chain reaction. Trends Genet. 5: 18;:.--L8S

White T. J., R. Made], D. H. Persuig.1992. The polymerase chain reaction: clinical applications. Adv. Clin, Chem. 29: 161-196.

Winter G., C.Milstein. 1991. Man-made antibodies. Nature 349:293-299.

Vu K. F., A. Van Deynze, K. P. Pauls.1993. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis, p. 287-301. In B.R. Click and J.E. Thompson (ed.). Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press, Boca Raton, Fla,

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Кратко опишите, как с помощью ПЦР можно выявить изменения в гене ß-глобина человека, приводящие к серповидноклеточной анемии.

2. Изложите принцип метода ПЦР/ЛОЗ.

3. Что такое метод EL1SA?

4. Опишите три способа нерадиоактивного мечения ДНК. Каковы преимущества нерадиоактивных методов детекции?

5. Перед вами стоит задача разработать простой, чувствительный и воспроизводимый тест для обнаружения содержащего двухцепочечную ДНК вируса, вызывающего летальную инфекцию у крупного рогатого скота. Поскольку эффективность лечения зависит от ранней и точной диагностики заболевания, необходимо использовать методы, позволяющие выявлять вирус при его минимальном содержании в организме инфицированного животного, еще до появления каких-либо симптомов заболевания. Кратко опишите и обоснуйте последовательность ваших действий.

6. Что означают чувствительность, специфичность и простота применительно к диагностическим тестам?

7. Как в настоящее время диагностируют болезнь Чагаса? Каким образом можно усовершенствовать существующую процедуру?

8. Почему использование флуоресцентных красителей облегчает обнаружение специфических нуклеотидных последовательностей?

9. Что такое зонд — «молекулярный маяк» и как он действует?

10. Что такое геномная дактилоскопия и как ее используют для характеристики следовых количеств ДНК в судебной медицине?

11. Что представляет собой метод RAPD и как его используют для выявления генетических вариантов растительных культур?

ГЛАВА 10.
Микробиологическое производство лекарственных средств

До появления технологии рекомбинантных ДНК многие лекарственные препараты на основе белков человека удавалось получать только в небольших количествах, их производство обходилось очень дорого, а механизм биологического действия иногда был недостаточно изучен. Предполагалось, что с помощью новой технологии можно будет получать весь спектр таких препаратов в количествах, достаточных как для их эффективного тестирования, так и для применения в клинике. И эти ожидания оправдались. На сегодняшний день клонировано более 400 генов (в основном в виде кДНК) различных белков человека, которые в принципе могут стать лекарственными препаратами. Большинство этих генов уже экспрессированы в клетках-хозяевах, и сейчас их продукты проходят проверку на возможность применения для лечения различных заболеваний человека (табл. 10.1). Впрочем, хотя более 30 таких биотехнологических препаратов и получило одобрение в США (табл. 10,2), пройдет еще несколько лет, прежде чем они будут рекомендованы для широкого использования и поступят в продажу; вначале их подвергнут проверке на животных и проведут тщательные клинические испытания. Однако фармацевтические фирмы уже сейчас проявляют к ним интерес. По подсчетам специалистов, ежегодный объем мирового рынка лекарственных препаратов на основе белков человека составляет около 150 млрд. долларов и постоянно растет. Объем мирового рынка лекарственных средств на основе рекомбинантных белков увеличивается на 12—14% в год и к 2000 г. составит примерно 20 млрд. долларов.

Разработка новых методов профилактики и лечения многих заболеваний человека внесла огромный вклад в рост благосостояния людей в XX в, Однако этот процесс никогда нельзя считать завершенным. Так называемые «старые» заболевания (например, туберкулез) могут дать о себе знать вновь, как только будут ослаблены профилактические меры или появятся резистентные штаммы. Весьма привлекательной выглядит перспектива применения в качестве терапевтических средств специфических антител; их можно будет использовать для нейтрализации токсинов, борьбы с бактериями, вирусами, для лечения раковых заболеваний. Антитело можно уподобить самонаводящейся ракете, которая либо нейтрализует «нарушителя» — чужеродный агент, либо, если она оснащена «боеголовкой», разрушает специфическую клетку-мишень. К сожалению, несмотря на многообещающие возможности, антитела довольно редко применялись для профилактики и лечения болезней и других патологий. И лишь в последнее время, с развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой методов получения моноклональных антител и с расшифровкой молекулярной структуры и функции иммуноглобулинов, интерес к применению специфических антител для лечения различных заболеваний вновь пробудился.

Лекарственные препараты

Выделение кДНК интерферонов

Для выделения генов или кДНК белков человека используют разные подходы. В ряде случаев выделяют нужный белок и определяют аминокислотную последовательность соответствую-

Микробиологическое производство лекарственных средств 205

щего участка молекулы. Исходя из этого находят кодирующую его нуклеотидную последовательность, синтезируют соответствующий олигонуклеотид и используют его в качестве гибридиза-ционного зонда для выделения нужного гена или кДНК из геномных или кДНК-библиотек. Другой подход состоит в выработке антител к очищенному белку и использовании их для скрининга библиотек, в которых происходит экспрессия определенных генов. Для белков человека, синтезируемых преимущественно в какой-то одной ткани, кДНК-библиотека, полученная на основе мРНК, выделенной из этой ткани, будет обогащена последовательностью ДНК-мишени. Например, основным белком, синтезируемым клетками островков Лангерганса поджелудочной железы, является инсулин, и 70% мРНК, выделенных из этих клеток, кодируют именно его. Однако принцип обогащения кДНК неприменим для тех белков человека, количество которых очень мало или место синтеза которых неизвестно. В этом случае могут понадобиться другие экспериментальные подходы. Интерфероны (ИФ) человека, включающие α-, β- и γ-интерфероны (ИФα, ΗΦβ, ИФγ), — это природные белки, каждый из которых может найти свое терапевтическое применение (табл. 10.3), При выделении их кДНК пришлось разработать новый подход, позволяющий преодолеть трудности, связанные с недостаточным содержани-

206 ГЛАВА 10

ем соответствующих мРН К и белков. Процедура выделения кДНК интерферонов состояла в следующем.

1. Из лейкоцитов человека выделили мРНК и фракционировали ее по размерам; провели обратную транскрипцию и встроили в сайт PstIплазмиды pBR322.

2. Полученным продуктом трансформировали Escherichia coli. Образовавшиеся 6000 клонов подразделили на 12 групп; по 512 клонов в каждой. Тестирования проводили на группе клонов, что позволило ускорить процесс их идентификации.

3. Каждую группу клонов гибридизовали с неочищенным препаратом ИФ-мРНК,

4. Из образовавшихся гибридов, содержащих клонированную ДНК и мРНК, выделили мРНК и провели ее трансляцию в бесклеточной системе синтеза белка.

5. Определили интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержали клон с кДНК, гибридизовшейся с ИФ-мРНК.

6. Позитивные группы разбили на 8 подгрупп, содержащих по 64 клона, и вновь провели тестирование. Разбиение на подгруппы повторяли до тех пор, пока не идентифицировали клон, содержащий полноразмерную ИФ-кДНК человека.

Если нужно получить большие количества ИФ, соответствующую кДНК можно субклонировать в экспрессирующем Е. соli-векторе, который позволяет достичь высокого уровня экспрессии.

Микробиологическое производство лекарственных средств 207

Интерфероны человека, полученные методом генной инженерии

Первый ген интерферона был выделен в начале 80-х гг. С тех пор было обнаружено несколько разных интерферонов. Как мы уже говорили, исходя из химических и биологических свойств всех их можно подразделить на три группы: ИФα, ИΦβ и ИФγ. ИФα и ИΦβ синтезируются клетками, обработанными препаратами вирусов или вирусной РНК, а ИФγ вырабатывается в ответ на действие веществ, стимулирующих рост клеток. ИФα кодируется семейством генов, включающим как минимум 15 неаллельных генов, в то время как ИΦβ и ИФγ колируются одним геном каждый. Подтипы ИФαпроявляют разную специфичность. Например, при проверке эффективности ИФα₁ и ИФα₂ на обработанной вирусом линии клеток быка эти интерфероны проявляют сходную противовирусную активность, в случае же обработанных вирусом клеток человека ИФα₂ оказывается в семь раз активнее, чем ИФα₁. Если противовирусная активность проверяется на клетках мыши, то ИФα₂ оказывается в 30 раз менее эффективным, чем ИФα₁.

Было предпринято несколько попыток создать ИФ с комбинированными свойствами, используя тот факт, что члены семейства ИФα различаются по степени и специфичности своей противовирусной активности. Теоретически этого можно достичь, соединив части последовательностей генов разных ИФα. Это приведет к образованию гибридного белка с другими свойствами, чем у каждого из исходных белков. Сравнение последовательностей кДНК ИФα₁ и ИФα₂ показало, что они содержат одинаковые сайты рестрикции в позициях 60, 92 и 150. После расщепления обеих кДНК в этих сайтах и последующего лигирования фрагментов было получено несколько гибридных генов (рис. 10.1). Эти гены экспрессировали в Е. coli, синтезированные белки очистили и исследовали их биологические функции. Проверка защитных свойств гибридных ИΦ на культуре клеток млекопитающих показала, что некоторые из них проявляют большую активность, чем родительские молекулы. Кроме того, многие гибридные ИФ индуцировали образование 2'—5'-олигоизоаденилат-синтетазы в контрольных клетках. Этот фермент участвует в синтезе 2'—5'-связанных олигонуклеотидов, которые в свою очередь активируют латентную клеточную эндорибонуклеазу, расщепляющую вирусную мРНК. Другие гибридные ИФ проявляли большую, чем родительские молекулы, антипролиферативную активность в культурах различных раковых клеток человека.

Рис. 10.1. Структура генов ИФa2, ИФa3 и четырех гибридных генов. Сравнение нуклеотидных последовательностей генов ИФa2 и ИФa3 обнаруживает наличие у них одинаковых сайтов для рестрицирующих эндонуклеаз (RE1, RE2, RE3). Рестрикция по этим сайтам и лигирование полученных фрагментов приводят к образованию различных гибридных генов. В нижней части рисунка представлены четыре из них.