ГЛАВА 2. Появление новых генотипов в смешанной культуре биохимических мутантов бактерий J

Появление новых генотипов в смешанной культуре биохимических мутантов бактерий J. Lederberg, E.L. Tatum Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 11: 113-114, 1946.
Почти до середины XX в, среди бактериологов господствовало мнение, что в отличие от других живых организмов бактерии при неблагоприятных внешних воздействиях выживают не благодаря случайным генетическим изменениям (мутациям), а вследствие того, что именно эти воздействия в большинстве случаев запускают физиологические процессы, которые и позволяют бактериям выжить. Эта теория была опровергнута исследованиями С.Е. Лурия и М. Дельбрюка (Luria S. E., Delbruck M., Genetics 28: 491-51 1, 1943), которые доказали, что устойчивость Е. coli к бактериальным вирусам (бактериофагам) обусловлена именно произошедшими в них мутациями, а не реакцией бактерий на воздействие со стороны бактериофага. Эти данные нашли подтверждение в работах других авторов, изучавших последствие других неблагоприятных внешних воздействий. Исследования Лурия— Дельбрюка положили начало современной генетике микроорганизмов.	В 1946 г. Ледерберг и Татум продемонстрировали, что между членами генетически неоднородной популяции E. coli может происходить обмен генетической информацией и что при этом, как и у двуполых организмов, в результате физического обмена между хромосомами могут возникать новые генетические комбинации (генетическая рекомбинация). Обнаружение этого замечательного феномена выдвинуло E, coli на передний фронт генетических исследований. Ледерберг и Татум создали различные штаммы E. coli, индуцируя те или иные мутации и отбирая клетки с разнообразными наследуемыми дефектами метаболизма. Например, одна чистая культура могла синтезировать вещества А, В и С, но не D или E (ее обозначили ABCde). Параллельно создали другую чистую культуру, abcDE. Смешав эта культуры, получили бактерии ABCDE. Ни в одной из чистых культур тип ABCDE не возникал спонтанно. Экспериментально	исключив остальные возможные причины образования комбинации ABCDE, Ледерберг и Татум пришли к выводу, что она возникает в результате физического обмена генетическим материалом между двумя хромосомами. Другими словами, у E. coli существует некое подобие аппарата полового размножения, который, как и у других организмов, обеспечивает создание новых комбинаций генов. Как заявил Лурия, это открытие может стать «одним из наиболее великих достижений за всю историю развития бактериологии», что впоследствии и подтвердилось. Вскоре появилась целая серия блестящих работ самого Ледерберга и других авторов, которые позволили установить, как работает генетическая система E. coli. Этот микроорганизм широко использовался как модельная система для изучения молекулярных основ синтеза нуклеиновых кислот и белков, а также других важнейших биологических процессов.

термостабильные ферменты, которые применяются в промышленных или в лабораторных процессах, а генетически видоизмененные психротрофы используют для биодеградации токсичных отходов, содержащихся в почве и воде, при пониженных температурах.

E. coli можно культивировать как в аэробных (в присутствии кислорода), так и в анаэробных (без кислорода) условиях. Однако для оптимальной продукции рекомбинантных белков E. coli и другие микроорганизмы обычно выращивают в аэробных условиях. Если целью культивирования бактерий в лаборатории является синтез и выделение определенного белка, то культуры выращивают на сложных жидких питательных средах в колбах. Для поддержания нужной температуры и обеспечения достаточной аэрации культуральной среды колбы помещают в водяную баню или термостатируемую комнату и непрерывно встряхивают. Такой аэрации достаточно для размножения клеток, но не всегда — для синтеза белка. Рост клеточной массы и продукция белка лимитируются не содержанием в питательной среде источников углерода или азота, а содержанием растворенного кислорода: при 20 °С оно равно примерно девяти миллионным долям. Это становится особенно важно при промышленном получении рекомбинантных белков с помощью микроорганизмов. Для обеспечения условий, оптимальных для максимальной продукции белков, конструируют специальные ферментеры и создают системы аэрации.

Биологические системы, использующиеся в молекулярной биотехнологии 27

Таблица 2.1. Некоторые генетически модифицированные микроорганизмы, использующиеся в биотехнологии

Acremonium chrysogenum

Bacillus brevis

Bacillus subtilis

Bacillus thuringiensis

Corynebacterium glutamicum

Erwmia herbicola

Escherichia coli

Pseudotnonas spp.

Rhizobium spp.

Streptomyces spp,

Trichoderma reesei

Xanthomonas campestris

Zymomonas mobilis

Помимо E. coli, в молекулярной биотехнологии используют множество других микроорганизмов (табл. 2.1). Их можно разделить на две группы: микроорганизмы как источники специфических генов и микроорганизмы, созданные генноинженерными методами для решения определенных задач. К специфическим генам относится, например, ген, кодирующий термостабильную ДНК-полимеразу, которая используется в широко применяемой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Этот ген был выделен из термофильных бактерий и клонирован в E. coli. Ко второй группе микроорганизмов относятся, например, различные штаммы Corynebacterium glutamicum, которые были генетически модифицированы с целью повышения продукции промышленно важных аминокислот.

Saccharomyces cerevisiae

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae — это непатогенные одноклеточные микроорганизмы с диаметром клетки примерно 5 мкм, которые во многих отношениях представляют собой эукариотический аналог E. coli. Их генетика, молекулярная биология и метаболизм детально изучены. S. cerevisiae размножаются почкованием и хорошо растут на такой же простой среде, как и Е. coli. Их способность к превращению сахара в этанол и углекислый газ издавна использовалась для изготовления алкогольных напитков и хлеба. В настоящее время ежегодно во всем мире расходуется более

1 млн. тонн S. cerevisiae. Дрожжи S. cerevisiae представляют также большой научный интерес. В частности, они являются наиболее удобной моделью для исследования других эукариот, в том числе человека, поскольку многие гены, ответственные за регуляцию клеточного деления S. cerevisiae, сходны с таковыми у человека. Это открытие способствовало идентификации и характеристике генов человека, отвечающих за развитие новообразований. Широко используемая генетическая система дрожжей (искусственная хромосома) является непременным участником всех исследований по изучению ДНК человека. В 19% г. была определена полная нуклеотидная последовательность всего набора хромосом S. cerevisiae, что еще более повысило ценность этого микроорганизма для научных исследований. Такая работа на эукариотах была выполнена впервые.

Синтезированный бактериальной клеткой эукариотический белок часто приходится подвергать ферментативной модификации, присоединяя к белковой молекуле низкомолекулярные соединения — во многих случаях это необходимо для правильного функционирования белка. К сожалению, E. coli и другие прокариоты не способны осуществлять эти модификации, поэтому для получения полноценных эукариотических белков используют S. cerevisiae, а также другие виды дрожжей: Kluyveromyces lactis, Saccharomyces diastaticus, Schizisaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Pichia postons, Hansenula pofymorpha. Наиболее эффективными продуцентами полноценных рекомбинантных белков являются P. pastoris и H. polymorpha.

Культуры эукариотических клеток

При всех различиях между типами эукариот методические подходы к культивированию клеток насекомых, растений и млекопитающих имеют много общего. Сначала берут небольшой кусочек ткани данного организма и обрабатывают его протеолитическими ферментами, расщепляющими белки межклеточного материала (при работе с растительными клетками добавляют специальные ферменты, разрушающие клеточную стенку). Высвободившиеся клетки помещают в сложную питательную среду, содержащую аминокислоты, антибиотики, витамины, соли,