Клонирование структурных генов эукариот

Структура генов прокариот очень проста: есть начало, есть конец, получается мРНК, которая имеет начало и конец, идет транскрипция, трансляция и белок (рис. 53, А). Даже если при фрагментировании геномной ДНК последовательность нуклеотидов, кодирующих структуру определенного белка, прерывается, метод частичного гидролиза позволяет получить рекомбинантные ДНК, в сумме представляющие собой полноразмерный структурный ген интересующего исследователя белка.

Рис. 53. Схема основных этапов экспрессии генов в клетках прокариот (А) и эукариот (Б)

Структура гена эукариот сложнее (рис. 53, Б). Из длинной пре-мРНК (первичный транскрипт) удаляются (вырезаются) интроны (insertion sequences, вставочные последовательности), а оставшиеся экзоны сшиваются в единую нить. Из пре-мРНК в результате процесса, который получил название сплайсинг, получается зрелая мРНК. Потом происходит трансляция зрелой мРНК, в результате образуется белок..

Проблемы клонирования эукариотических генов в системе прокариот включает два основных момента:

1. Прокариоты не способны удалять интроны из первичных РНК-транскриптов, поэтому правильная трансляция эукариотических мРНК в бактериальной клетке невозможна.

2. Экспрессия эукариотической ДНК может осуществляться только при наличии эукариотических сигнальных последовательностей, регулирующих транскрипцию и трансляцию (кэп, поли-А-хвост и др.)

В связи с этим для клонирования генов эукариот разработаны и применяются другие схемы. Можно выделить основные этапы таких экспериментальных подходов:

· выделение мРНК на колонках, заполненных олиго(dT)-целлюлозой или олиго(dT)-сефарозой;

· cинтез одноцепочечной кДНК на матрице мРНК с помощью ревертазы, праймера олиго(dT) и четырех dNTP;

· cинтез двухцепочечной кДНК;

· gосле завершения синтеза молекулы мРНК гидролизуют РНК-азой Н, а ДНК обрабатывают нуклеазой SI, в результате чего получаются линейные молекулы ДНК с тупыми концами без шпилек;

· кДНК встраивают в плазмидный вектор и получают кДНК-библиотеку.

Для скрининга кДНК-библиотеки также можно использовать метод гибридизации или иммунологические методы.