COSY із затримкою: виявлення малих КССВ.

Послідовність COSY є винятково ефективною для виявлення малих КССВ між протонами. Однак, такі кроспіки зазвичай занадто малоінтенсивні і їхня ідентифікація може бути утрудненою. Експеримент COSY із затримкою (Рис. 5.50)

Рис 5.50.COSY із затримкою. Додаткова фіксована затримка вводиться в базову послідовність COSY щоб підсилювати кореляції маленьких КССВ (див. текст).

дозволяє збільшити інтенсивність кореляцій, які пов'язані з константами, що менші, ніж природна ширина лінії. Це дозволяє відстежити взаємодію через багато зв'язків, тому такий експеримент називають ще COSY великого діапазону (COSY із затримкою). Кореляції через 4 або 5 зв'язків у жорстких або ненасичених системах, такі як W-, алільні або гомоалільні КССВ, можуть спостерігатися навіть у тому випадку, якщо в одномірному спектрі вони не проявляються (Рис. 5.51). У попередніх розділах вказувалося, що для здійснення перенесення когерентності потрібна протифазна орієнтація векторів намагніченості в мультиплетах.

Рис.5.51.(а) Стандартний COSY-90 спектр і (б) спектр COSY із затримкою для сполуки 5.6. В (б) була використана додаткова затримка D в 200 мс у той час як інші параметри були такі самі як і в (a). Маленькі (1 Гц) розщеплення, що невидимі в стандартному COSY експерименті, добре проявились в спектрі (б).

Для дуже малих КССВ протифазна орієнтація за звичайних умов збору даних COSY може відбутися через занадто великий час. Тому кроспіки для таких констант виявляються слабкими або взагалі невидимими. Існує можливість підвищити інтенсивність цих піків шляхом зміни величин періодів t₁і t₂ таким чином, щоб оптимізувати перенесення когерентності для малих КССВ, і, відповідно, підвищити інтенсивність кроспіків між ними. Цього в принципі можна досягти шляхом збільшення обох часових інтервалів у послідовності COSY і відповідним збільшенням цифрового розділення в обох вимірах. Але при цьому отримуються винятково великі масиви даних і час експерименту значно зростає.

В альтернативному підході, що застосовується в експерименті COSY із затримкою, після кожного імпульсу вводиться фіксований проміжок. При цьому час еволюції спінів зростає, а цифрове розділення залишається тим самим, що й у стандартній послідовності COSY. Використання додаткових затримок перешкоджає можливості фазочутливого подання спектрів через виникнення значних фазових викривлень. Тому в цьому випадку застосовується тільки подання спектрів в абсолютних значеннях.

Для оптимального детектування малих КССВ максимальне перенесення когерентності сигналу повинне відбуватися в середині кожного з часових інтервалів. Можна показати, що максимум досягається за час t, де

t = tan^-1(pJT₂)/pJ (5.12)

Якщо J мале, так що JT₂<<1, можна прийняти, що t = T₂ і вважати, що середина кожного інтервалу відповідає максимуму перенесення когерентності, тоді тривалість додаткового інтервалу, D, можна знайти зі співвідношення:

D = T₂ – 1/2AQ (5.13)

AQ – це загальний час збору даних по t₁ і t₂. Для типових параметрів COSY і типових величин Т₂ для протонів, величини D лежать у діапазоні 50-500 мс. Оскільки дійсний час релаксації протонів Т₂ найчастіше невідомий і він відрізняється для різних протонів, для інтервалу затримки вибирають компромісне значення 200 мс. Така величина підходить у більшості випадків. Кроспіки, які пов'язані з більшими величинами КССВ, у даному експерименті значно послаблюються. Тому перед застосуванням даної методики варто вимірювати також і спектр COSY за стандартних умов.

5.21. Спектроскопія тотальних кореляцій (TOCSY)

Фізична природа всіх описаних вище експериментів COSY полягає в безпосередній кореляції гомоядерних спінів через наявну скалярну спін-спінову взаємодію. У протонній спектроскопії ці методи дають можливість хіміку спостерігати гемінальні і віцинальні взаємодії між протонами в молекулі. Спектроскопія тотальних кореляцій (TOCSY) також дає спектри протонних кореляцій через спін-спінову взаємодію, але крім цього вона виявляє кореляції між протонами, що належать до однієї спінової системи, навіть у тому випадку, якщо безпосередній спіновий зв'язок між ними відсутній (КССВ = 0). Інакше кажучи, якщо є ланцюжок груп А-В-С-D і т.д., що містять протони, між якими є спіновий зв'язок, то послідовність TOCSY здійснює перенесення намагніченості від спіна А до В, С, D і т.д. шляхом естафетної передачі когерентності уздовж ланцюга спіново зв’язаних ядер. У принципі можлива повна кореляція всіх наявних у молекулі протонів, що й дало підставу назвати дану методику спектроскопією тотальних кореляцій. Можливість перенесення намагніченості такого типу дає винятково потужний метод складання карт кореляцій, незважаючи на те, що в таких спектрах є значні фазові викривлення в обох вимірах. Особливо корисним метод буває у випадках, коли декілька сигналів перекривається і метод COSY не дає однозначного результату. На рис. 5.52 наведений спектр TOCSY сполуки 5.1. Він записаний так, щоб проілюструвати покрокові перенесення намагніченості уздовж вуглеводного циклу.

Рис.5.52.TOCSY спектр сполуки 5.1. Естафетні кроспіки виникають між спінами які не зв'язані скалярним розщепленням але перебувають в одній спіновій системі. Вони утворюються через поширення намагніченості на весь ланцюжок зв'язаних спінів. Порівняєте зі спектром COSY, що показаний на Рис. 5.12.

При цьому корисно зробити порівняння зі спектром COSY для даного зразка, який наведений на рис. 5.12. Додаткові естафетні кроспіки в TOCSY відповідають кореляціям між всіма спінами циклічної системи. Таким чином, з'являється можливість скласти повну карту спін-спінових взаємодій, незважаючи на перекривання частини сигналів. Як видно з рисунку, в даному випадку маємо горизонтальні ряди кроспіків для кожного з сигналів. Таким чином, на відміну від COSY, кроспіки багаторазово повторюються і вірогідність їхнього співпадання зменшується. Тому, якщо в спектрі хоча б один з горизонтальних рядів кроспіків видимий повністю, то з нього можна знайти всі можливі кореляції, а отже і хімічні зсуви всіх протонів, що входять до спінової системи. Як правило, кроспіки, що відповідають гемінальним та віцинальним КССВ мають більшу інтенсивність, ніж всі інші. Це видно з більшої площі кроспіку.

Беручи до уваги структуру спектру TOCSY, його слід аналізувати дещо інакше, ніж спектр COSY. Тут аналізу піддають послідовно кожний з горизонтальних (або вертикальних) рядів кореляцій, що відповідають кожному з сигналів протонів, приналежних даній спіновій системі. В ряду відмічають найбільш інтенсивні кореляції, що відповідають гемінальним та віцинальним КССВ. Якщо якісь кореляції є невидимими в даному ряду через перекривання сигналів, їх знаходять, базуючись на інших рядах кореляцій, де співпадання сигналів не відбувається. Таким чином можна побудувати таблицю кореляцій для кожної зі спінових систем, що містяться у спектрі. Співставлення даних такої таблиці зі структурною формулою спінової системи дає можливість здійснити віднесення сигналів всіх протонів. Хоча аналіз спектру TOCSY дещо складніший від аналізу спектру COSY, але він дає змогу проаналізувати ССВ у значно більш складних протонних спектрах.

Ще одна важлива перевага TOCSY у порівнянні з COSY, є те, що тут відбувається перенесення намагніченостей, що перебувають у фазі. Тому відпадає проблема взаємного знищення компонентів мультиплетів при недостатньому цифровому розділенні або великій ширині ліній. У цих випадках метод TOCSY за чутливістю перевершує COSY.