Идентификация нуклеиновых кислот

Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (НК) основывается на способности НК специфически соединяться (гибридизироваться) с комплементарными фрагментами гомологичных ДНК или РНК искусственно созданных нитей, меченных изотопами или ферментами (пероксидаза, щелочная фосфатаза).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). В случаях когда в исследуемом материале ДНК или РНК мало или недостаточно для того, чтобы установить её точную генетическую принадлежность, прибегают к полимеразной цепной реакции, основу которой составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий определённого участка ДНК.ПЦР была разработана в 1983 году американским учёным Керри Мюллисом. В 1993 году К. Мюллис за свои исследования был удостоен Нобелевской премии.

ДНК состоит из двух цепей, построенных из четырёх нуклеотидов: аденина, тимина, гуанина, цитозина (А, Т, Г, Ц). Последовательность нуклеотидов одной цепи комплементарна последовательности другой. У каждой цепи есть 3’- и 5’-концы. 3’-конец одной цепи связан с 5’-концом другой. ДНК-полимераза узнает азотистые основания в цепочке-матрице и наращивает вторую цепочку от 3’- к 5’-концу ДНК, делая подобие негатива. В среде, где производится синтез, должен присутствовать строительный материал – свободные нуклеотиды. ДНК-полимераза начинает работать только тогда, когда к цепи ДНК присоединяется праймер. Праймер представляет собой небольшую цепочку нуклеотидов, служащую затравкой для синтеза новой цепи. С матрицей она соединяется комплементарно. В праймере должно быть не менее 20-30 нуклеотидов: чем их больше, тем точнее выбирается антипоследовательность. Многократно повторяя эту операцию, полимераза способна удлинять 3’-конец праймера до тех пор, пока не достигнет 5’-конца матрицы. Однако если добавить в среду дидезоксинуклеотидтрифосфат (ddNTP), например, дидезоксиаденин (ddA), дальнейший рост цепи невозможен, поскольку к 3’-концу нуклеотиды присоединяться уже не могут.

Зная последовательность оснований, на его границе синтезируют праймер-антипоследовательность из 20-30 нуклеотидов. Их добавляют к препарату расплетённой ДНК, они связываются с родственным участком. С этого места начинает работать фермент-копировщик ДНК-полимераза. Чтобы ограничить нужный участок с другой стороны, с 3’-конца, нужны ddNTP четырёх типов. Копия антипараллельна, и по ней ДНК-полимераза движется в обратную сторону. Работу она начинает с праймера ко второму граничному участку (он должен быть антипоследовательностью, то есть таким же, как в матрице). Дойдя до конца, который был началом в предыдущем проходе, фермент уже во втором цикле выдаёт точную копию избранного участка. Полимераза копирует её в следующем цикле, потом обе копии, потом – 4 и т.д. Заставив полимеразу работать дальше побочных продуктов реакции - копий с длинными хвостами с обеих сторон, будет всё меньше. После 20 проходов будет около 1 миллиона копий нужного участка, а других фрагментов – лишь несколько десятков.