Доказательство белковой природы ферментов

Принцип метода. Раствор фермента слюны амилазы, химическая природа которого изучается, обрабатывается раствором протеолитического фермента пепсина. В дальнейшем активность изучаемого фермента испытывается по способности расщеплять субстрат (крахмал). Оптимум рН пепсина – 1,5-2,5, амилазы – 6,8-7,2.

Ход определения. В первую пробирку наливают 1 мл раствора пепсина в HCl, во вторую – 1 мл 0,2н раствора соляной кислоты (контрольная проба). В обе пробирки добавляют по 1 мл раствора слюны, тщательно смешивают и помещают на 40 минут в термостат при температуре 37°С. По истечении указанного времени в каждую пробирку добавляют по 1 мл 0,1% раствора крахмала, предварительно нейтрализовав содержимое обеих пробирок добавлением нескольких капель раствора едкого натра (нейтрализация контролируется индикаторной бумагой). Затем обе пробирки помещают в термостат на 20 минут. После извлечения проб из термостата в каждую пробирку добавляют по 1-2 капли раствора йода и наблюдают за появившейся окраской.

На основании результатов опыта необходимо сделать соответствующие выводы о химической (белковой) природе фермента амилазы.

Тема 1.4. КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ.

Вопросы для самоподготовки

1) Что такое удельная активность ферментов?

2) Что понимают под числом оборотов фермента?

3) Каково диагностическое значение определения активности ферментов в биологических жидкостях?

4) Что принято за единицу активности фермента?

5) Перечислите факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.

6) Нарисуйте график зависимости скорости ферментативной реакции от температуры.

7) Что такое температурный оптимум ферментов?

8) Чему равен температурный оптимум для большинства ферментов человеческого организма?

9) Нарисуйте график зависимости скорости ферментативной реакции от рН среды.

10) Что такое оптимум рН фермента?

11) Какой оптимум рН у:

1. амилазы слюны;

2. пепсина;

3. хемотрипсина.

12) Нарисуйте график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.

13) Напишите математическое выражение зависимости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

14) Нарисуйте график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.

15) Что такое константа Михаэлиса? Какие свойства фермента характеризуются константой Михаэлиса?

16) Какой вид принимает уравнение Михаэлиса-Ментен при очень низких концентрациях субстрата?

17) Какой вид принимает уравнение Михаэлиса-Ментен при высоких концентрациях субстрата?

18) Нарисуйте график Лайнуивера-Берка зависимости скорости от концентрации субстрата.

19) Чему равна величина, отсекаемая на оси ординат при построении графика Лайнуивера-Берка?

20) Чему равна величина, отсекаемая на оси абсцисс при построении графика Лайнуивера-Берка?

21) Какие принципы положены в основу классификации ферментов?

22) Перечислите 6 классов ферментов.

23) Какой тип реакции катализируют оксидоредуктазы?

24) Перечислите подклассы оксидоредуктаз.

25) Какой тип реакций катализируют трансферазы?

26) Перечислите основные подклассы трансфераз.

27) Какой тип реакций катализируют лиазы?

28) Перечислите основные подклассы лиаз.

29) Какой тип реакций катализируют лигазы?

30) Какой тип реакций катализируют изомеразы?

31) Какой тип реакций катализируют гидролазы?

32) Назовите коферменты, которые входят в состав дегидрогеназ.

33) Перечислите основные подклассы гидролаз.

34) Какую функцию выполняют коферменты дегидрогеназ?

35) Назовите витамины, активной формой которых является НАД.

36) Перечислите функциональные группы, которые окисляют (дегидрируют) НАД-зависимые дегидрогеназы.

37) Назовите витамин, активной формой которого является ФАД.

38) Перечислите функциональные группы, которые дегидрируют ФАД‑зависимые дегидрогеназы.

39) Перечислите, что указывается в названии фермента, согласно правилам комиссии по ферментам Международного биохимического союза.

Вопросы, задачи и упражнения для самоконтроля

1) Оптимальные условия действия лактатдегидрогеназы, катализирующей реакцию превращения пирувата в лактат: температура – 37°С, рН – 7,5. Объясните причины уменьшения активности фермента:

1. при повышении температуры до 60°С;

2. во время хранения ферментного препарата при рН – 5,0.

2) Существует количественная зависимость между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции. Эта зависимость выражается уравнением Михаэлиса-Ментен. Напишите уравнение Михаэлиса-Ментен. Какой вид принимает это уравнение при очень низких и очень высоких концентрациях субстрата?

3) Нарисуйте кривую зависимости между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции, катализируемой регуляторным ферментом. Сравните эту кривую с кривой Михаэлиса-Ментен. Чем объясняется отличие кривых?

4) Зависимость скорости реакции, катализируемой транскарбамоилазой, от концентрации субстрата выражается кривой, имеющей сигмоидную форму. После обработки фермента солями ртути каталитическая активность увеличилась примерно в 4 раза, а кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата приобрела форму гиперболы. Нарисуйте график, иллюстрирующий приведенные данные. Какие выводы о структуре и внутримолекулярных взаимодействиях в ферменте можно сделать на основании этих данных?

Литература

1. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: Высшая школа, 1989. –
С. 70-81.

2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – С. 105-115, 126-128.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 134-145.

4. Задания на самоподготовку по биологической химии.

5. Задания для самостоятельной работы студентов лечебного и медико-профилактического факультетов.

6. Тестовые задания по биохимии.

7. Лекционный материал.

8. Лабораторная работа. Алейникова Т.В., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. – М.: Высшая школа, 1988. – Лабораторные работы № 31, 41, 34.

9. Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. – С. 39-41.