Введение в генетическую инженерию

Вопросы: Цель генной инженерии. Этапы становления генной инженерии. Методы генной инженерии. Методы переноса чужеродных генов в клетки. Рекомбинантные микроорганизмы. Получение рекомбинантных белков. Получение генетически модифицированных организмов. ДНК-технологии в растениеводстве. Трансгенез в растениеводстве.

Молекулярная биотехнология, (а) как ее видят авторы одноименного учебника Глик и Пастернак, это направление, возникшее на стыке биотехнологии и генной инженерии. (б) Другое определение – это направление, возникшее на стыке традиционной биотехнологии, молекулярной биологии и генетики. (в) Существует также определение молекулярной биотехнологии как объединения технологии рекомбинантной ДНК с промышленной микробиологией. Но такой молек. биотехнология была только на начальном этапе.

Главное направление генной инженерии - это перенос одного или нескольких генов из одного организма в другой. Центральным звеном генной инженерии является технология рекомбинантной ДНК. Изобретение способов конструирования новых организмов с чужеродными генами имел революционное значение для практической биологии. Как пишет, произошел переворот во взаимоотношения человека с живой природой.

Объектами генной инженерии являются: микроорганизмы, многоклеточные организмы, клеточные линии насекомых, растений, млекопитающих, вирусы бактерий, насекомых, растений, млекопитающих. В случае вирусов и организмов (а не клеток), генетически модифицированная самовоспроизводящаяся биологическая единица часто является конечным продуктом биотехнологии. Наиболее часто используемыми генно-модифицированными микроорганизмами являются E. coli и Sacch. cerevisiae.

Основные группы продуктов биотехнологии, связанных с генной-инженерией: (1) органы или биомасса с/х растений (урожай), (2) органы или биомасса с/х животных (продукция животноводства), (4) полезные метаболиты микроорганизмов, (5) вакцины, диагностические вещества (белки, используемые для иммунодиагностики), (6) лекарства, (7) штаммы микроорганизмов, создаваемые для биодеградации нежелательных веществ.

Если целью генной инженерии является создание организма-продуцента белка, то существуют 2 варианта реализации данной цели: (а) получение известного белка, только на основе организма, взятого в качестве биофабрики, который данный белок не вырабатывает, либо (б) получение искусственно сконструированного белка, т.е. того, который ранее не существовал в природе. Т.е. во втором случае имеет место белковая инженерия через посредничество белок-кодирующего гена.

С другой стороны, существуют 2 типа продуцентов чужеродных белков: секретирующие и несекретирующие белок в окружающую среду.

Главные этапы создания генно-модифицированных организмов:

(1) выбор собственно продукта, который будет получен на основе организма;

(2) выбор подходящего организма-продуцента;

(3) конструирование вектора – молекулярного переносчика ДНК в клетку хозяина;

(3а) выделение тотальной ДНК из клетки-инсточника гена;

(3б) выделение отдельно взятого гена;

(3в) подбор вектора;

(3г) введение в вектор гена, кодирующего фенотипический маркер;

(3д) «сшивка» гена с вектором;

(4) введение ДНК (вектора) в клетку (организм) хозяина;

(5) отбор успешно трансформированных клеток или организмов;

(6) обеспечение правильного функционирования нового гена в организме нового хозяина (оптимизация экспрессии);

(7) при необходимости – модификация клонированных (введенных в новый организм, чужеродных) генов на уровне нуклеотидов, с целью их улучшения.

Векторы: интегративные и неинтегративные.

Векторами,используемыми в различных организмах-продуцентах, являются:

для бактерий – вирусы (бактериофаги) и плазмиды

для грибов – плазмиды

для растений – плазмиды агробактерий; применяется также бомбардировка микрочастицами (биолистика). Материал – золото или вольфрам, диам. 0.4-1.2 мкм. Частицы покрывают молекулами ДНК. Обстрел такой дробью производится из порохового пистолета. Благодаря высокой плотности о большой скорости, микродробь пробивает клеточные стенки и мембраны, и ДНК затем каким-то неизвестным способом встранивается в геном.

для животных – вирусы

Краткая история и коммерциализация молекулярной биотехнологии.

Впервые перенос чужеродного гена в клетку (бактерии E. coli) был произведен в 1973 г.: Cohen, Boyer и Berg (Коэн, Бойер и Берг) ввели с помощью плазмидного вектора и заставили клонироваться фрагмент ДНК лягушки в клетке бактерии. Правда, этот ген не был белок-кодирующим, он кодировал рибосомальную РНК.