Генетичні основи застосування культури клітин в селекційних цілях

Клітини в культурі in vitro відрізняються за морфологією, за біохімічними властивостями, за фізіологічним станом і генетично. Різноманітність (варіабельність) серед клітинних ліній або рослин-регенерантів називають сомаклональною варіабельністю. Генетична природа і механізм виникнення сомаклональної мінливості поки що мало вивчені. Однак чітко можна виділити залежність виникнення сомаклональних варіантів, перш за все, від генетичної гетерогенності соматичних клітин вихідного експлантанту, генетичної і епігенетичної мінливості, індукуємої умовами культивування in vitro, а також від генотипа вихідного експлантату.

Поліморфізм культивованих клітин можна пояснити видовими і віковими особливостями, рівнем плоїдності, впливом складу поживного середовища і умов культивування, відсутністю корелятивних зв’язків. Останній фактор, провідний до порушення жорсткої регуляції, яка існувала в цілій рослині, очевидно, являється основною причиною спонтанною мінливості клітин in vitro.

Будь-який фрагмент рослини являє собою мозаїку різноманітних тканин, і в залежності від того, яка тканина дасть початок каллусу, виникші навіть з однакових експлантантіва каллуси будуть гетерогенними і відрізнятися один від одного. Однакових в повному сенсі, експлантантів в природі бути не може, отже, неорідність вихідного матеріалу (видова, вікова, фізіологічна) передбачає різноякісність клітин в культурі.

Фізіологічна гетерогенність полягає в тому, що клітини в популяції знаходяться в різному фізіологічному стані, тобто діляться, ростуть, старіють, помирають. Така культура називається асинхронною. Змусити популяцію клітин вищих рослин проходити фази клітинного циклу одночасно, тобто синхронізувати їх майже неможливо. Тому що та частина клітин, яка здатна в даний момент до поділу, складає 2 – 4 %. Несприятливі умови (низька температура, вилучення важливих компонентів живлення), які затримують поділ, в певній мірі сприяють накопиченню чисельності клітин, готових до поділу. Більш ефективні деякі хімічні речовини, які блокують певні стадії підготовки до поділу. В кращих випадках синхронізація може бути досягнута досягнута у 10 – 30 % клітин, але при наступних поділах популяція знову швидко втрачає синхронність.

Варто підкреслити, що фізіологічна варіабельність клітин в суспензійній культурі менше в порівнянні з культурою каллусної тканини на агарі, що пов’язано з більш однорідними умовами живлення, аерації і видалення токсичних метаболітів з клітинного оточення в рідкому переміщуваному середовищі.

Гетерогенність культивованих клітин обумовлена генетичною, епігенетичною і модифікаційною мінливістю. Генетичні або мутаційні, призводять до зміни генотипу, яка може бути успадкована. Мутації (зміна кількольсті або структури ДНК) відбуваються на генному, хромосомному і геномному рівнях.

Гення, або точкова мутація означає зміну структури ДНК в одному локусі. Генні мутації призводять до сильних чи слабких змін змін морфологічних, біохімічних і фізіологічних властивостей клітини. Мутації, які виникають в результаті зміни макроструктури хромосом, називаються хромосомними мутаціями, або хромосомними абераціями (перебудовами). Структурні перебудови хромосом виникають в результаті інверсії, делеції, дуплікації, транслокації і транспозиції. Геномні мутації пов’язані зі зміною числа хромосом в ядрі, тобто зі змінами в каріотипі.

Усі види названих генетичних змін мають місце у клітин in vitro. Найбільш докладно досліджена хромосомна мінливість клітин in vitro. Навіть клітини однієї й тієї ж тканини, які вирощуються в одній ємності, можуть значно відрізнятися між собою за хромосомним набором (диплоїдні, поліплоїдні, анеуплоїдні). Причини генетичної мінливості різноманітні: 1) порушення корелятивних зв’язків при виділенні первинного експлантату з рослини, тобто відсутність організменного контролю; 2) дія компонентів середовища; 3) вплив продуктів метаболізму, які накопичуються у середовищі; 4) гетерогенність вихідного матеріалу і селекція клітин певного типу.

Хромосомна мінливість являється результатом порушень мітозу, які називаються ендомітозом і ендоредуплікацією. При ендомітозі відбувається спіралізація хромосом і починається мітоз, але порушується веретено поділу, зберігається оболонка ядра, хромосоми не розходяться і деспіралізуються всередині ядерної оболонки. Це призводить до зростання числа хромосом, збільшення розмірів ядра і клітин. Ендоредуплікація не супроводжується утворенням хромосом і поділом ядра, хоча вміст ДНК в ядрі теж збільшується. До утворення поліплоїдних і анеуплоїдних клітин також призводять порушення в мітозі, пов’язані з неправильним розподілом хромосом.

Клітини різного рівня плоїдності відрізняються за швидкістю поділу і росту, за стійкістю до несприятливих умов, починають конкурувати, і одні з них починають переважати. Такий процес зростаючого домінування в популяції клітин певного типу називається клітинною селекцією. Домінування може бути викликане переважною проліферацією одних клітин або успішною елімінацією (видаленням) інших. Таку селекцію правильніше називати авто селекцією, тому що вона протікає спонтанно, без спеціальної дії будь-якими стресовими факторами. В процесі авто селекції формується найбільш пристосований до даних умов каріотип. Вірогідно, клітини пристосовуються до нових умов існування шляхом відбору більш життєздатних поліплоїдних клітин. Цікаво, що зміна умов вирощування змінює напрям відбору. Показано, наприклад, що високі концентрації 2,4-Д і кінетину збільшують можливість поліплоїдизації.

Те, що умови вирощування відіграють важливу роль у формуванні цитогенетичної гетерогенності, добре видно з дослідів з тканиною гаплопапуса. В лабораторії Р.Г. Бутенко протягом двох років культивувались меристематичні клітини цієї рослини, пасажі проводилися раз в місяць. В результаті вихідні диплоїдні клітини на 95 % набули інші рівні плоїдності. Шведський дослідник Т. Еріксон, працюючи з цією ж тканиною пересаджував її на свіже поживне середовище через кожні 2 дні. При цьому штам зберіг стабільну диплоїдну характеристику. Однак спосіб вирощування не може повністю гарантувати генетичну стабільність в популяції клітин, так як генетичною гетерогенністю може володіти сам вихідний матеріал. У багатьох рослин диференційовані тканини мають клітини різної плоїдності. Спеціалізовані клітини, наприклад клітини зеленої асимілюючої паренхіми листка, запасаючих тканин м’ясистих коренів, клубнів зазвичай виявляються поліплоїдними.

Спонтанне або індуковане будь-яким фактором утворення різних варіантних форм рослин можна використовувати для покращення уже існуючих сортів сільськогосподарських культур.

Як було зазначено, клітини in vitro стають різноякісними також завдяки епігенетичним змінам, тобто змінам в програмі зчитування генів чи потенції до їх активації. Ці зміни генної активності являються спадковими.

До неспадкових змін у клітин в культурі відносяться модифікаційні зміни, які в більшості випадків носять адаптивний, пристосувальний характер. Ці зміни не зачіпають генетичних структур клітини, вони відповідають фізіологічній адаптації, при якій межі змін не перевищують норму реакції, обумовленої генотипом.

Гетерогенність клітин in vitro зростає зі збільшенням часу їх культивування. Різні типи морфогенезу – соматичний ембріогенез або органогенез – також можуть по різному впливати не генетичні зміни і, відповідно, на фенотипі рослин. Експериментально встановлено, що при соматичному ембріогенезі час проходження циклу клітина – рослина значно коротший, ніж при органогенезі, тому ступінь подібності отриманого матеріалу і вихідного батьківського генотипу значно вище.

Сомаклональні варіанти мають, безперечно, практичне застосування в сільськогосподарській практиці, в силу появи форм, які відрізняються від батьківських за різноманітними біохімічними, якісними і кількісними ознаками, а також цитогенетичним характеристикам. Наприклад, отримано сомаклони картоплі сорту Зарево, які відрізняються високою врожайністю, підвищеною стійкістю до захворювань, більш високим вмістом в бульбах протеїну та крохмалю. Причому успадкування важливих ознак при розмноженні бульбами зберігалось протягом трьох років польових досліджень (В.В. Сидоров та ін., 1984, 1985). Для рослин тютюну отримано через каллусну культуру сома клони, стійкі до вірусу тютюнової мозаїки. В даний час метод культури тканин почав широко використовуватися в селекції не лише кормових і технічних культур, але і декоративних та лікарських рослин. Прикладом тому може служити новий сорт пеларгонії Velvet Rose, одержаний через каллусну культуру.

Таким чином, отримані позитивні результати свідчать про необхідність більш ефективного запровадження різних прийомів одержання сомаклональних варіантів в практику селекційної роботи, і найбільш реальним являється застосування сомаклональної мінливості для покращення чи «допрацювання» уже існуючих сортів чи ліній за окремими невистачаючими ознаками.

Не дивлячись на те, що існує генетична нестабільність культур ізольованих тканин і клітин рослин, вона не може забезпечити потреби селекціонерів в генетичній різноманітності. В зв’язку з цим для пришвидшення селекційного процесу в культурі клітин використовуються хімічні і фізичні мутагени. Обробка тканини раувольфії зміїної азотистим іпритом в концентрації 2,5∙10^-3 М призвела до підвищення рівня аберацій хромосом в першому пасажі до 32 %, викликала зсув популяції в сторону збільшення триплоїдів. В результаті вдалося одержати штам з більш високою біосинтетичною активністю в порівнянні з вихідною тканиною.

Спонтанний та індукований мутагенез в культурі клітин, тканин і протопластів дозволяє одержувати рослини, які являють собою практичний інтерес для селекціонерів. Важливе практичне значення має створення форм рослин, стійних до несприятливої дії факторів зовнішнього середовища, таких як низькі температури, засолення грунтів, забруднення природного середовища токсичними речовинами, ураження шкідниками та збудниками хвороб. Ці фактори можуть бути використані в якості селективного фону в процесі клітинної селекції. Клітини, які зберегли при цьому життєздатність, можуть бути регенеровані в цілі рослини.

Принципової різниці в результатах клітинної селекції при спонтанному та індукованому мутагенезі немає. Для підвищення частоти мутацій в соматичних клітинах зазвичай використовують такі мутагени, як нітрозогуанідин, нітрозометилсечовина, метилметансульфонат. Рідше застосовують опромінення ультрафіолетом, γ-квантами 60 Гц та нейтронами.

В якості селективних агентів використовують антибіотики, інгібітори синтезу нуклеїнових кислот, аналоги пуринових і піримідинових основ, фіто- і патотоксини, агенти, які викликають сольовий і водний стрес, аналоги амінокислот та ін.

Для проведення клітинної селекції використовують наступні прийоми:

– пряма (позитивна) селекція, при якій виживає лише певний шуканий мутантний тип клітин;

– непряма (негативна) селекція, заснована на вибірковій загибелі клітин дикого типу, що діляться і виживанні метаболічно неактивних клітин, але, яка потребує додаткової ідентифікації у них мутаційних змін;

– тотальна селекція, при якій індивідуально тестуються усі клітинні клони;

– візуальна селекція і неселективний відбір, коли варіантна лінія може бути ідентифікована серед усієї популяції клітин візуально або при використанні біохімічних методів (тонкошарова або рідинна хроматографія, радіоімунний аналіз, мікроспектрометрія та ін.).

З перерахованих вище прийомів клітинної селекції пряма селекція являється найбільш поширеним методом і використовується головним чином для виділення рослин-регенерантів, стійких, наприклад, до гербіцидів, антибіотиків, токсинів, важких металів, солям та іншим антиметаболітам.