Лекція № 7. Технологія одержання ферментних препаратів

1. Промислові способи одержання ферментів, їхнє застосування.

2. Глибинний метод культивування продуцентів ферментів.

3. Поверхневий метод культивування продуцентів ферментів.

4. Іммобілізація ферментів.

5. Класифікація носіїв.

6. Методи іммобілізації.

7. Застосування іммобілізованих ферментів.

8. Іммобілізація клітин.

Класифікація ферментів основана на механізмі їхньої дії й включає 6 класів. Ферменти – біокаталізатори володіють рядом унікальних властивостей, наприклад, таких як висока каталітична активність і вибірковість дії. У ряді випадків ферменти мають абсолютну специфічність, каталізуючи перетворення тільки однієї речовини. Для кожного ферменту існує свій оптимум рН, при якому його каталітична дія максимальна. При різкій зміні рН ферменти інактивуються шляхом необоротної денатурації. Прискорення реакції при підвищенні температури також лімітовано певними межами, оскільки вже при температурі 40 – 50°С багато ферментів денатурують. Ці властивості ферментів доводиться враховувати при розробці технології нового препарату.

Оскільки ферменти – речовини білкової природи, у суміші з іншими білками їх кількість визначити практично неможливо. Наявність ферменту в препараті може бути встановлена лише за протіканням тієї реакції, яку каталізує фермент. При цьому кількісну оцінку вмісту ферменту можна дати, визначивши або кількість продуктів реакції, які утворилися, або кількість субстрату, що витратився. За одиницю активності ферменту приймають ту його кількість, яка каталізує перетворення одного мікромоля субстрату за 1 хвилину при заданих стандартних умовах – стандартна одиниця активності.

За рішенням Міжнародного біохімічного союзу активність вирішено визначати при t = 30°С за початковою швидкістю реакції, коли концентрація насичення ферменту й тимчасова залежність близька до кінетики реакції нульового порядку. Інші параметри реакції індивідуальні для кожного ферменту. Активність препарату, який випускається – найважливіший нормований показник якості.

Основну частину ферментів, які одержують промисловим способом, становлять гідролази. До них відносяться, у першу чергу амілолітичні ферменти: α-амілаза, β-амілаза, глюкоамілаза. Їхня основна функція – гідроліз крохмалю й глікогену. Крохмаль при гідролізі розщеплюється на декстрини, а потім до глюкози. Ці ферменти застосовуються в спиртовій промисловості, хлібопеченні.

Протеолітичні ферменти належать до класу пептидгідролаз. Їх дія полягає в прискоренні гідролізу пептидних зв'язків у білках і пептидах. Важлива їхня особливість – селективний характер дії на пептидні зв'язки в білковій молекулі. Наприклад, пепсин діє тільки на зв'язок з ароматичними амінокислотами, трипсин – на зв'язок між аргініном і лізином. У промисловості протеолітичні ферменти класифікують за здатністю проявляти активність у певній області рН: рН 1,5 – 3,7 – кислі протеази; рН 6,5 – 7,5 – протеази; pН > 8.0 – лужні протеази.

Протеази знаходять широке застосування в різних галузях промисловості: м'ясна – для пом'якшення м'яса; шкіряна – пом'якшення шкір; кіновиробництво – розчинення желатинового шару при регенерації плівок; парфумерна – добавки в зубну пасту, креми, лосьйони; виробництво миючих засобів – добавки для видалення забруднень білкової природи; медицина – при лікуванні запальних процесів, тромбозів і т.д.

Пектолітичні ферменти зменшують молекулярну масу й знижують в'язкість пектинових речовин. Пектинази діляться на дві групи – гідролази й транселімінази. Гідролази відокремлюють метильні залишки або розривають глікозидні зв'язки. Транселімінази прискорюють негідролітичне розщеплення пектинових речовин з утворенням подвійних зв'язків. Застосовуються в текстильній промисловості (вимочування льону перед переробкою), у виноробстві – висвітлення вин, а також при консервуванні фруктових соків.

Целюлолітичні ферменти дуже специфічні, їхня дія проявляється в деполімеризації молекул целюлози. Використовуються у вигляді комплексу, який здійснює гідроліз целюлози до глюкози (у гідролізній промисловості). У медичній промисловості їх використовують для виділення стероїдів з рослин, у харчовій – для поліпшення якості рослинних масел, у сільському господарстві – як добавки в комбікорми для жуйних тварин.

Існує ряд факторів, які впливають на біосинтез ферментів. У першу чергу, до них відноситься генетичний. Склад і кількість синтезованих ферментів спадково детерміновані. Застосовуючи мутагени можна змінити генетичні властивості мікроорганізмів й одержати штами з необхідними для промисловості властивостями. До мутагенних факторів відносяться іонізуюче й неіонізуюче випромінювання, ізотопи, антибіотики, інші хімічні сполуки, які перетворюють спадкоємні елементи клітини. Незважаючи на визначальну роль генетичного фактора в біосинтезі ферментів, продуктивність біотехнологічних процесів залежить і від складу поживного середовища При цьому важливим є не тільки наявність джерел основних поживних речовин, але й речовин, що відіграють роль індукторів або репресорів біосинтезу даного конкретного ферменту або його груп. Механізм цього явища ще не цілком вивчений, але сам факт повинен ураховуватися при виборі технології.

Розглянемо кілька прикладів. Фермент ліпаза майже не синтезується грибом Aspergillus awamori на середовищі без індуктора, додавання жиру кашалота підсилює біосинтез ферменту в сотні разів. При додаванні ж у середовище крохмалю й при повному видаленні мінерального фосфору інтенсивно синтезується фосфатаза. Не тільки наявність індуктора здатна збільшувати вихід ферменту. Важливу роль відіграє склад поживного середовища й умови культивування. При розробці процесу біосинтезу α-амілази культурою Aspergillus oryzae заміна сахарози (як джерела вуглецю) на крохмаль збільшила активність ферменту в 3 рази, додавання солодового екстракту (із пророслого насіння злакових) ще в 10 разів, а підвищення концентрації основних елементів поживного середовища на 50% – ще в 2 рази.

Для інтенсифікації процесу росту й синтезу ферментів додають різні фактори росту, наприклад, амінокислоти, пуринові основи та їх похідні, РНК і продукти їх гідролізу. Як джерело вуглецю використовують крохмаль, кукурудзяний екстракт, соєве борошно, гідролізати біомаси дріжджів. Мікроорганізми можуть утилізувати й мінеральні джерела азоту. До складу поживного середовища входять й іони Mg, Mn, Zn, Fe, Cu й ін. метали. Механізм дії більшості з них невідомий. Деякі входять до складу ферменту. Іони Ca підвищують стійкість α-амілази, іони Fe й Mg активізують і стабілізують протеолітичні ферменти.

Оптимальний склад поживного середовища для кожного продуцента може бути визначений двома способами: емпіричним і побудовою математичної моделі з використанням комп'ютера. Останній, природно, переважніше. За характером культивування всі технологічні процеси виробництва ферментних препаратів діляться на дві групи: глибинний і поверхневий методи.