Використання методів генетичної інженерії в створенні ферментних препаратів

Для отримання продуцентів використовують:

- селекція

- мутагенез

- генетично-інженерні методи

Генна інженерія. Три напрямки:

- збільшення копійності генів

- використання сильних промоторів

- модифікація білків

Збільшення копійності генів – це використання багатоколійних плазмід, які вводять в продуцент.

Модифікація білків:

1). Модифіковані ферменти отримують сайт-спрямованим мутагенезом вихідних генів, тобто заміна однієї або декількох амінокислот на рівні генів.

Для цього in vitro хімічно синтезують необхідну ДНК-послідовність і цю послідовність вбудовують в необхідний ядерний геном продуценту або в плазміду, яку вносять в продуцент.

Приклади:

- якщо в молекулі фосфоліпази замінити аспарагін на аспарагінову кислоту та глутамін на лізин, то підвищується специфічна активність даного ферменту.

- заміна однієї амінокислоти тирозину тРНК-синтази в Bacillus збільшила спорідненість цього ферменту до АТФ в 100 разів.

- заміна амінокислоти на інші, що призводить до збільшення термостабільності, до граничних значень рН, це досягається змінами третинної структури, яка обумовлена сульфгідридними зв’язками ( цистеїн або додається, або забирається).

2). Модифікація ферменту також здійснюється за допомогою вбудовування або виключення субстрат зв’язуючого домену ферменту (замінюється послідовність амінокислот). Приклад: в результаті введення в молекули глікозилтрансферази, целюлозозв’язуючого домену, фермент набуває здатності зшивати розриви молекул в аморфних ділянках целюлози.

3). Конструювання гібридних молекул полягає в створенні гена, що складається з ділянок, що кодують функціональні домени двох близьких або різних білків. В результаті розширюється субстратна специфічність, або 2 біохімічні ланцюга поєднуються в один.

Конструювання таких гібридних молекул здійснюють за допомогою:

- трансдукція

- класична трансформація

- кон’югація

- метод злиття протопластів

Продуцент – E. coli

Продукуються ферменти як бактеріальні, так і грибні.

Також використовують бактерії: Bacillus subtilis, гриби: Asp.niger, Thrihoderma.

Отримані продукти (рекомбінантні ферменти) мають більшу чистоту; легше виділяються та очищуються; мають кращі фізико-хімічні властивості; вищу активність.