Выделение индивидуального белка

Для выделения индивидуального белка из смеси белков с близкими физико-химическими свойствами используют: 1) различия по молекулярной массе (методы ультрацентрифугирования и гель­хроматографии); 2) различия в заряде (методы электрофореза и ионообменной хроматографии); 3) способность белков к специфическим взаимодействиям (аф­финная хроматография).

Разделение по молекулярной массе. 1) Ультрацентрифугирование позволяет получить в центрифужных пробирках, вращающихся со скоростью до 85000 об/мин ускорение силы тяжести 300000 - 500000 g, при этом белки с разной молекулярной массой будут двигаться к дну пробирки с разной скоростью. На дно осядут самые тяжелые белки, затем средние и легкие. 2) Гель-фильтрация осуществляется с помощью молекулярных сит, например, сефадексов. Это нитевидные молекулы полисахарида декстрана, сшитые через определенные промежутки поперечными связями и свернутые в гранулы. В зависимости от размеров пор выпускают ряд марок сефадексов: G-200; G-100; G-75 и др.

Разделение по заряду.1) Электрофорез. Белки, имеющие разное количество ионогенных радикалов в полипептидной цепи имеют в растворе разные заряды, а поэтому в электрическом поле будут двигаться с разной скоростью. Обычно используют электрофорез в полиакриламидном геле. Перспективен метод изоэлектрического фокусирования. 2) Ионообменная хроматография заключается в ионном обмене между полимером, заполнившим колонку (катионообменник, анионообменник), и заряженным белком, пропускаемым через колонку.

Разделение на основе специфического связывания. Аффинная хроматография, или хроматография по сродству.Метод основан на специфическом взаимодействии молекулы белка с определенным лигандом. Готовят матрицу, с которой сшивают соединение (лиганд), обратимо и специфично связывающийся с искомым белком. Затем через колонку пропускают смесь белков. С лигандом матрицы свяжется только искомый белок за счет специфического взаимодействия, а нейтральные белки будут удалены с растворителем. Затем не представляет труда снять этот белок. Для этого через колонку пропускают раствор с высокой концентрацией свободного лиганда. Часто используют вариант свободного лиганда, имеющего более высокое сродство к белку, чем у фиксированного на матрице лиганда.