Люминесценция и миграция энергии в биологических объектах. Ароматические аминокислоты.

Ароматические аминокислоты (триптофан, тирозин, фенилаланин) являются основными флуоресцирующими компонентами белков. Особый интерес представляет флуоресценция триптофана. Во-первых, она самая сильная, во-вторых, она наиболее изучена и находит существенные применения. Характеристики триптофана, входящего в состав белка изменяются в широких пределах. Так, максимум флуоресценции расположен от 331 нм (химотрипсиноген, актин) до 350 нм (папаин), а квантовый выход изменяется от нуля до 50%. Анализ характеристик флуоресценции триптофана во многих белках, а также исследования производных индола в различных средах позволили установить большую чувствительность флуоресценции триптофана к окружению. Была сформулирована гипотеза наличия в белках трех состояний остатков триптофана, каждому из которых соответствует определенный набор параметров, характеризующих флуоресценцию. Это удалось сделать рассмотрев новый параметр, характеризующий форму спектра флуоресценции, Dl, ширину спектра флуоресценции на половине высоты. Оказалось, что как для нативных, так и для денатурированных мочевиной белков, спектры флуоресценции триптофановых остатков можно представить как сумму с определенными весами трех структурно различных классов:

I класс: lm=330-332 нм Dl=48-50 нм

II класс: lm=340-342 нм Dl=53-55 нм

III класс: lm=350-353 нм Dl=59-61 нм

Была предложена номограмма, позволяющая по определенным из опыта значениям lm и Dl вычислить вклад каждого класса во флуоресценцию данного белка. Так, например для белка b‑амилазы (рН7) lm=355 нм, Dl=53,7 нм, и вклад I класса составляет 0,55, II класса – 0,35, а III класса – 0,1. С помощью опытов с тушителями были определены структурные особенности расположения остатков триптофана разных классов. Так, класс I соответствует остаткам триптофана, расположенным внутри молекулы белка, обладающим небольшим квантовым выходом флуоресценции (0,1). Класс II составляют остатки триптофана, находящиеся на поверхности молекулы, они характеризуются большим квантовым выходом флуоресценции (0,3–0,4). Класс III соответствует поверхностным остаткам триптофана, обладающим большой подвижностью и большим контактом с растворителем, примерно таким, как в денатурированных белках. Квантовый выход остатков III класса составляет 0,17–0,25.

Физический смысл и роль в предложенной гипотезе р параметра Dl к настоящему времени остается невыясненной.

Рассмотрим тирозиновую и фенилаланиновую флуоресценцию в белках. Поскольку эти аминокислоты флуоресцируют слабее, чем триптофан, флуоресценцию их удобно исследовать на белках, не содержащих триптофана. В воде флуоресценция тирозина имеет максимум при 303 нм и квантовый выход 0,21. При включении тирозина в белок квантовый выход уменьшается в 8-10 раз. Считается, что это происходит в результате существования в белке некоторого тушителя, т.е. молекулярной группы, находящейся на достаточно близком расстоянии от тирозина и тушащей его флуоресценцию. Было показано, что таким тушителем может быть пептидная группа. (Розенхек, Вебер, 1961; Коугилл, 1967).

Остатки тирозина по флуоресценции могут быть классифицированы следующим образом (Коугилл, 1969, 1970):

1.Поверхностные остатки с большим квантовым выходом (0,21). Тушение пептидными группами отсутствует из-за включения тирозина в спиральные участки.

2.Остатки тирозина с флуоресценцией, потушенной гидратированным карбонилом пептидной группы (j=0,052–0,073).

3.Остатки, флуоресценция которых потушена дисульфидными группами при непосредственном контакте.

4.Остатки тирозина, флуоресценция которых потушена другими остатками тирозина, ионизированными в щелочной среде.

5.Гидрофобные остатки тирозина, образующие водородную связь с карбонильной группой пептидной группы.

6.Тирозиновые остатки, флуоресценция которых тушится в результате соударений с ионизированной карбоксильной группой, степень тушения зависит от частоты соударений.

7.Тирозиновые остатки, флуоресценция которых потушена остатками 5 и 6 типов, тушение зависит от взаимного расположения остатков.

8.Тирозиновые остатки, флуоресценция которых потушена за счет переноса энергии на триптофановые остатки.

Как правило, внутренние остатки тирозина имеют флуоресценцию по 5 и 7 типу. Рассмотрим теперь флуоресценцию фенилаланина. Фенилаланин имеет самую слабую флуоресценцию из ароматических аминокислот. Она наблюдается только в белках, не содержащих триптофан и тирозин. Это белки: парвальбумин (связывающие Сa2+) из мышцы рыб, гематокупреин лошади, супероксиддисмутаза зеленого горошка и рибосомный белок L7 E. Coly (максимум флуоресценции около 282 нм с плечами около 289 и 305 нм.) Спектры в белках имеют тонкую структуру, как и в водном растворе, но максимумы сдвинуты на 2 – 2.5 нм в длинноволновую сторону. Весьма интересным является то обстоятельство, что квантовый выход в белке (парвальбумине мерлузы) выше (0.061), чем в водном растворе (0.038). Это объясняется отсутствием в белке тушения флуоресценции фенилаланина водой.

Фосфоресценция ароматических аминокислот не нашла широкого применения в биофизических исследованиях. Тем не менее ее основные характеристики: триптофан при 77 К имеет фосфоресценцию с максимумами 405, 430, 456 нм и t 3-5 с; тирозин – λmax 387 нм, t ~ 0.9-0.3 с. В 60‑х годах была экспериментально показана резонансная миграция энергии между ароматическими аминокислотами по схеме: фенилаланин ® тирозин ® триптофан. Однако эти работы не получили в дальнейшем экспериментального развития и применения.

Перейдем теперь к люминесцентным свойствам нуклеиновых кислот и их компонент. Рассмотрим сначала флуоресценцию оснований при обычных и комнатных (??????) температурах. Эти данные приведены в таблице 3.

Таблица 3

Рассмотрим теперь фосфоресценцию замороженных растворов оснований. Оказалось, что фосфоресцируют только пурины при 77 К, рН 7.7. Характеристики фосфоресценции приведены в таблице 4.

Таблица 4

Вещество	(нм)	j	t(с)
Пурин		0.038
Аденин		0.045	2.3
Гуанин		0.036	1.2

Флуоресценция нуклеиновых кислот определяется флуоресценцией пуринов. В водном растворе максимум флуоресценции ДНК расположен при 358 нм. При 77 К в замороженном растворе в смеси этиленгликоль-вода (1:1) λm=335-360 нм. При исследовании порошка ДНК при 77 К наблюдалась широкая полоса флуоресценции при 335-340 нм с максимумом 350 нм.

В последнее время было показано (Рапопорт, 1982), что на люминесцентные свойства нуклеотидов и нуклеозидов сильно влияет образование водородной связи с растворителем. При образовании Н‑связи происходит тушение люминесценции.

При исследовании временных характеристик флюоресценции полинуклеотидов (О. Елинек, 1985) была обнаружена зависимость времени затухания флюоресценции поли‑А при 77 К от конформации.

Фосфоресценцию ДНК не удалось наблюдать ни при каких состояниях образца. Возможно, что ионы металлов (Cu, Fe), присутствующие в ДНК, эффективно тушат ее фосфоресценцию.