Практическая часть. Постановка реакции агглютинации на стекле и в пробирках

Постановка реакции агглютинации на стекле и в пробирках

Во всех иммунологических реакциях основным компонентом является антиген, который обладает двумя свойствами:

1) способностью вызывать иммунологический процесс в организме;

2) способностью соединяться с антителами в серологических реакциях.

Реакции взаимодействия антитела с антигеном называются серологическими (от лат. serum — сыворотка). Серологические реакции используют:

1) для обнаружения в сыворотке крови антител к тому или иному микробу с помощью известного специфического антигена;

2) для установления вида или типа выделенного микроба по его антигенной структуре с помощью диагностической сыворотки, содержащей известные специфические антитела.

Посуда и аппаратура для постановки серологических реакций

Посуда:

1) пробирки химические и центрифужные;

2) колбы Эрленмейера и плоскодонные;

3) пипетки пастеровские объемом 10 и 5 мл с делениями на 0,1 мл;

4) градуированные цилиндры.

Посуда должна быть чистой и сухой. Для ее обработки нельзя применять дезинфицирующие средства (карболовая кислота, хлорамин), кислоты и щелочи. Посуду кипятят в простой воде. Стерилизовать серологическую посуду не обязательно.

Аппаратура:

1. Штативы с гнездами.

2. Термостат и водяная баня с терморегуляторами.

3. Центрифуга на 2000—3000 обмин.

4. Агглютиноскоп.

Реакция агглютинации (РА)

Агглютинацией называется обнаруживаемое невооруженным глазом склеивание и вьшадение в осадок микробных тел при взаимодействии их со специфическими антителами.

РА получила большое распространение в микробиологической практике для диагноза:

1) брюшного тифа;

2) паратифов А и Б (реакция Видаля);

3) сыпного тифа;

4) бруцеллеза (реакция Райта);

5) туляремия и др.

Постановка развернутой реакции агглютинации объемным способом Для постановки реакции требуется:

1) сыворотка крови, подлежащая исследованию, 0,1—0,2 мл;

2) физиологический раствор;

3) корпускулярный антиген: взвесь живой 20-часовой культуры микробов.

Используются культуры только в S-форме (гладкие, блестящие колонии с ровными краями).

Приготовление разведений сыворотки больного:

Из сыворотки готовят ряд последовательных разведений, от 1:50— 1:100 до 1:1600— 1:3200. В отдельной пробирке готовят первое разведение сыворотки 1:50 или 1:100. Для этого градуированной пипеткой набирают 0,1 мл сыворотки, другой пипеткой прибавляют к ней 4,9мл (1:50) или 9,9 мл (1:100) физиологического раствора. Основной раствор сыворотки используется для приготовления последовательных, двукратных разведений. По окончании разведений во все пробирки ряда (кроме контрольной) прибавляют по 2—3 капли антигена. Пробирки встряхивают и ставят на 2 часа в термостат при температуре 37 °С. Затем учитывают предварительный результат реакции. Окончательный результат реакции агглютинации регистрируют через 18—20 часов стояния пробирок при комнатной температуре.

Положительный результат реакции агглютинации характеризуется образованием на дне пробирки осадка с выраженным просветлением надосадочной жидкости.

Осадок на дне пробирки, образовавшийся в результате склеивания микробных тел, называется агглютинатом.

Для регистрации результатов реакции агглютинации пользуются четырехкрестовой системой обозначения: + + + н— полная агглютинация, при которой большой осадок на дне располагается кучкой или в форме открытого перевернутого зонтика. Надосадочная жидкость прозрачная; + + + — почти полная агглютинация, осадок такой же, надосадочная жидкость почти прозрачная; + + — слабая агглютинация, осадок едва заметен, жидкость непрозрачная; + — отмечаются следы агглютинации;

— отрицательная реакция, содержимое пробирки равномерно мутное.

Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдается агглютинация, считают ее титром.

Постановка реакции агглютинации на стекле

Эта реакция считается ориентировочной. Ею часто пользуются для определения вида микроба.

1. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят с помощью пастеровской пипетки 2 капли агглютинирующей сыворотки.

2. В сыворотку вносят исследуемую бактериальную культуру, снятую с поверхности плотной питательной среды.

3. Внесенную культуру тщательно перемешивают. Реакция протекает при комнатной температуре. Результат учитывают с помощью лупы через 5—10 мин.

При положительной реакция в капле отмечается окучивание бактерий в виде зернышек или хлопьев.

Факторы естественной резистентности организма. Методы их изучения. Фагоцитоз

У человека и высших животных фагоцитарной способностью обладают клетки ретикуло-эндотелиальной системы: лейкоциты крови и лимфы, фиксированные купферовские клетки печени, ретикулярные клетки селезенки, костного мозга, лимфатических узлов, гистиоциты рыхлой соединительной ткани.

В борьбе с патогенными микробами большую роль играют лейкоциты. Судьба микроорганизмов, захваченных лейкоцитами, может иметь три исхода:

1) полное внутриклеточное переваривание микробов, приводящее к их исчезновению в лейкоците, — завершенный фагоцитоз;

2) выталкивание микробов из лейкоцитов обратно, в окружающую среду;

3) активное размножение микробов внутри лейкоцитов, — незавершенный фагоцитоз.

В последнем случае фагоцитоз приобретает отрицательное значение для организма, так как микробы, находящиеся внутри клеток, становятся менее доступными действию антител. Незавершенный фагоцитоз имеет место при заболевании туберкулезом, бруцеллезом, туляремией, гонореей.

Представление о фагоцитарной способности лейкоцитов крови можно получить по данным фагоцитарной активности лейкоцитов.

Определение фагоцитарной активности лейкоцитов

Фагоцитарная активность лейкоцитов выражается процентом активных лейкоцитов (фагоцитов) к общему числу подсчитанных нейтрофильных лейкоцитов.

В стерильную центрифужную пробирку наливают 0,2 мл 2% лимоннокислого натрия, прибавляют 0,1 мл исследуемой крови, взятой из пальца, и 0,05 мл микробной взвеси. Пробирку осторожно встряхивают, помещают на 30 мин в термостат при температуре 37 °С. Затем смесь центрифугируют при 2000—3000 обмин до расслоения жидкости на верхний — соломенно-желтый прозрачный слой плазмы, нижний — слой эритроцитов и среднюю серебристую пленку между ними — слой лейкоцитов. Пастеровской пипеткой отсасывают вначале верхний слой, затем очень осторожно снимают средний, делают из него 3—5 мазков и окрашивают их.

При микроскопии мазка подсчитывают число фагоцитировавших нейтрофильных лейкоцитов из общего числа подсчитанных лейкоцитов. Для получения достоверных результатов количество последних должно быть не меньше 100. Полученный результат выражают в процентах.

Анафилактический шок

1. Информация, позволяющая медицинскому работнику заподозрить анафилактический шок:

1.1. На фоне или сразу после введения лекарственного препарата, сыворотки, укуса насекомого и т, д. появились слабость, головокружение, затруднение дыхания, чувство нехватки воздуха, беспокойство, чувство жара во всем теле, иногда рвота.

1.2. Кожа бледная, холодная влажная, дыхание частое, поверхностное. Систолическое давление 90 мм рт. ст. или ниже. В тяжелых случаях угнетение создания и дыхания. 2. Тактика медицинского работника

ДЕЙСТВИЯ

ОБОСНОВАНИЕ

1. Вызвать врача

2. Если анафилактический шок развился на внутривенное введение лекарственного препарата, то:

1. Прекратить введение препарата, сохранить венозный доступ

Снижение дозы аллергена

2. Придать устойчивое боковое положение, вынуть зубные протезы

Профилактика асфиксии

3. Приподнять ножной конец кровати

Улучшение кровоснабжения мозга

4. Дать 100% увлажненный кислород

Снижение гипоксии

5. Измерить АД и ЧСС

Контроль состояния

3. При внутримышечном введении:

1. Прекратить введение препарата

Замедление всасывания препарата

2. Положить пузырь со льдом на место инъекции

3. Обеспечить внутривенный доступ

4. Повторить этапы стандарта со 2 по 4 как при шоке на внутривенное введение

3. Подготовить медикаменты, аппаратуру, инструментарий:

3.1. Адреналин (амп.), преднизолон (амп.), дипразин (амп.), димедрол (амп.), циметидин (амп.), эуфиллин (амп.), полиглюкин (фл.), 0,9% хлорида натрия (фл.), реополигл юкин.

3.2. Систему для внутривенного вливания, шприцы и иглы для вм и ик инъекций, жгут, аппарат ИВ Л, пульсо-ксиметр, коникотом, набор для интубации трахеи, мешок Амбу.

4. Оценка достигнутого:

4.1. Восстановление сознания, стабилизация артериального давления, сердечного ритма.