Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ).

Високоефективна рідинна хроматографія (ВЕРХ, англійською мовою – HPLC) – це метод розділення речовин, у якому рухомою фазою є рідина, а нерухомою фазою є тонкодисперсна тверда речовина, або рідина, нанесена на твердий носій, або твердий тонкодисперсний носій, хімічно модифікований введенням органічних груп. Розділення речовин у рідинній хроматографії базується на механізмах сорбції, розподілу, іоного обміну або розділення за розмірами молекул. Воно відбувається у колонці рідинного хроматографа, куди під високим тиском подається рідина.

Рідинний хроматограф (рис.4.15, 4.16)складається з системи подачі рухомої фази, блока вводу проби, хроматографічної колонки, детектора і реєструючого пристрою. Рухома фаза звичайно подається під тиском із однієї або декількох посудин і протікає через блок вводу проби, колонку, а потім через детектор із заданою швидкістю. Сигнал від детектора перетворюється, підсилюється і реєструється у вигляді хроматограми, аналогічно до хроматограми у газовій хроматографії.

Для вводу проби використовують петлеві дозатори, спеціальні мікрошприци або систему автоматичного пробовідбору.

Рідинний хроматограф – це складніший ніж газовий хроматограф прилад. Це пов’язано з тим, що система подачі елюента містить деякі додаткові вузли: систему дегазації, пристрій для створення градієнту, насоси та вимірювачі тиску. Насоси повинні забезпечити швидкість потоку від 0,1 до 10 мл/хв при тиску до 400 атм.

Температуру хроматографічної колонки підтримують постійною. Склад рухомої фази може або залишатись постійним протягом всього аналізу (ізократичне елюювання), або може змінюватись відповідно до заданої програми (градієнтне елюювання).

У ВЕРХ звичайно використовують прямі колонки довжиною 10, 15, 25 см з внутрішнім діаметром 4-5,5 мм. У мікроколонкових хроматографах використовують колонки довжиною 5-6 см і діаметром 1-2 мм. Колонки виготовляють зі скла або нержавіючої сталі.

Колонки заповнюють частинками сорбенту або твердого носія, на поверхню частинок якого нанесена тонка плівка рідкої нерухомої фази. Розмір частинок твердого носія становить 5-10 мкм. Твердий носій готують з поверхнево-пористих матеріалів – силікагелю з привитими на поверхні різними функціональними групами, алюмогелю, пористих стекол, полімерних сорбентів.

Рідка нерухома фаза, нанесена на поверхню твердого носія, становить 0,75-1,5 % від маси твердого носія. Звичайно для розділення полярних речовин використовують полярні нерухомі фази і малополярні рухомі фази. Неполярні речовини ділять на неполярних нерухомих фазах з використанням полярних рухомих фаз. Рідкими нерухомими фазами служать речовини різної хімічної природи: гліколі, нітрили, силікони тощо.

У ВЕРХ використовують як нормально-фазовий, так і обернено-фазовий варіанти. У першому випадку полярність нерухомої фази вища за полярність рухомої фази, у другому, навпаки, полярність нерухомої фази є нижчою від полярності рухомої фази.

Для безперервного контролю складу елюату, який витікає з колонки, у рідинній хроматографії звичайно використовують диференційні рефрактометри, фотометричні, УФ-спектрофотометричні, люмінесцентні і кондуктометричні детектори.

Рис. 4. 15.Система високоефективної рідинної хроматографії

Рис. 4.16. Схема будови рідинного хроматографа

Диференційний рефрактометр – це універсальний детектор. Він дозволяє визначити загальний показник заломлення системи проба-елюент, тобто сигнал дають усі компоненти, показник заломлення яких відрізняється від показника заломлення елюенту. Його чутливість » 10^{-6 г, діапазон лінійності становить 4 порядки. Цей детектор чутливий до зміни температури, тому вимагає термостатування.}

УФ-детектор – працює при одній і тій же довжині хвилі, що відповідає найбільш інтенсивній лінії ртутної лампи низького тиску λ = 253,7 нм. Флуоресцентна приставка дозволяє збуджувати випромінювання з λ = 280 нм. УФ-детектор найбільш чутливим є у випадках, коли молярні коефіцієнти світлопоглинання компонентів високі, а елюент не поглинає в ультрафіолетовій області спектру. У цьому випадку можна використовувати метод градієнтного елюювання. При λ = 254 нм можна визначати будь-які ароматичні сполуки, більшість кетонів та альдегідів (e = 20-10⁴). УФ-детектор селективний, дає можливість визначати 10^{-9 г, його діапазон лінійності} » 5 порядків.

Фотометри та спектрофотометри дають можливість працювати при будь-якій довжині хвилі (190-650 нм), вони реєструють зміну поглинання в часі при певній довжині хвилі або в зупиненому потоці елюенту знімають спектр. Швидкозаписуючий спектрофотометр записує всю спектральну область за 20 с. Спектрофотометричний детектор з лінійкою із 211 діодів на підкладці із кремнію дає можливість вимірювати одночасно велику кількість смуг у вузькому інтервалі довжин хвиль. Отриману інформацію обробляє комп’ютер і зберігає в пам’яті для побудови графіка. Флуоресцентні детектори чутливіші від спектрофотометричних приблизно у сто разів. Їх застосовують для визначення мікродомішок.

Кондуктометричний детектор використовують у іонообмінній хроматографії для вимірювання провідності розчинів (Ом^-1), пропорційної до числа іонів у розчині, їх рухливості. Сигнал детектора лінійно залежить від концентрації іонів у широкому інтервалі – від 0,01 мкг/мл до 100 мкг/мл. Високочутливе кондуктометричне детектування з автоматичним записом сигналу дає межу визначення nּ10^-3 мкг/мл. Використання концентруючої колонки дає можливість знизити межу визначення на 2-3 порядки.

Проточний лазерний нефелометр, а також мікрокомп'ютери, які видають результати визначення середніх молекулярних мас за спеціальними програмами, використовують у ексклюзійній хроматографії для аналізу полімерів.

Ідентифікацію речовин у ВЕРХ звичайно проводять одним із таких способів:

- порівняння часу утримування досліджуваної речовини у випробовуваній пробі і розчині порівняння. Розчин порівняння – це розчин чистої досліджуваної речовини, присутність якої передбачається у випробовуваній пробі.

- порівняння відносного часу утримування аналізованої речовини у випробовуваній пробі і розчині порівняння. Відносний час утримування – це відношення часу утримування аналізованої речовини до часу утримування речовини, взятої за стандарт;

- порівняння хроматограми випробовуваної проби з хроматограмою розчину порівняння або хроматограмою, наведеною у окремій статті.

Найчастіше використовують перший спосіб. Другий спосіб доцільно використовувати, якщо умови хроматографування є важко відтворюваними. Третій спосіб доцільно застосовувати для препаратів рослинного і тваринного походження.

Рис. 4.17. Хроматограма визначення лікарського препарату "Ibuprofen" в сироватці крові людини методом внутрішнього стандарту (внутрішній стандарт – Ibufenac).

Кількісне визначення проводять методом абсолютного калібрування та методом внутрішнього стандарту.

Абсолютне калібрування. Цей метод полягає у побудові калібрувального графіку залежності площі піків досліджуваної речовини від її вмісту (концентрації) в пробі. Для цього готують ряд стандартних розчинів з різною концентрацією досліджуваної речовини (не менше 5 розчинів кожної концентрації) і аналізують на хроматографі. Для кожного значення концентрації розраховують середнє значення площі піків і будують градуювальний графік - графік залежності площі хроматографічного піку досліджуваної речовини від концентрації або вмісту цієї сполуки у розчині. Після цього у тих самих умовах хроматографують досліджувану пробу з невідомою концентрацією (декілька паралельних досліджень), вимірюють площу піку досліджуваної речовини і розраховують середні значення площі піків. За градуювальним графіком знаходять концентрацію аналізованої речовини у випробовуваному розчині.

Метод внутрішнього стандарту. Цей метод полягає у внесенні до розчину досліджуваної речовини внутрішнього стандарту. Внутрішній стандарт (речовина-стандарт) – це, як правило, близька за хімічною структурою до досліджуваної речовини сполука, пік якої на хроматограмі знаходиться поруч з піком досліджуваної речовини (рис.4.17)

Градуювальним графіком цього методу є графік залежності відношення площ піків досліджуваної речовини до площ піків внутрішнього стандарту від вмісту (концентрації) досліджуваної речовини в пробі. Для цього готують ряд стандартних розчинів з різною концентрацією досліджуваної речовини (не менше 5 розчинів кожної концентрації) і однакової концентрації внутрішнього стандарту. З цих розчинів готують проби змішуванням однакових об’ємів розчинів досліджуваної речовини і внутрішнього стандарту, які аналізують на хроматографі. Для кожного значення концентрації розраховують середнє значення площі піків і будують градуювальний графік - графік залежності відношення площі піків досліджуваної речовини і внутрішнього стандарту від концентрації або вмісту досліджуваної речовини у розчині. Для випробовуваного розчину пробу готують аналогічно. За градуювальним графіком знаходять концентрацію аналізованої речовини у випробовуваному розчині.

Дані, отримані в результаті аналізу методом ВЕРХ, представляють, вказуючи, звичайно, наступні характеристики: розміри хроматографічної колонки і матеріал, з якого вона виготовлена, тип нерухомої фази, розмір частинок нерухомої фази, температуру колонки, швидкість і склад рухомої фази, тип детектора.

Обов’язковою умовою є попередня перевірка придатності хроматографічної системи для розділення досліджуваної суміші, зокрема:

- відносні часи утримування досліджуваних речовин мають бути близькими до зазначених у методиці величин;

- число теоретичних тарілок (ефективність хроматографічної системи), розраховане за зазначеним піком, має бути не меншим зазначеної величини;

- коефіцієнт розділення зазначених піків, розрахований з хроматограм розчину порівняння, має бути не менше зазначеної величини;

- відносне стандартне відхилення, розраховане для висоти або площі зазначеного піка або їхніх відношень до висоти або площі піка внутрішнього стандарту з хроматограм розчину порівняння, має бути не більше зазначеної величини; для розрахунку відносного стандартного відхилення використовують дані звичайно п’яти паралельних хроматограм.

Коли представляють результати кількісного аналізу, необхідна їх статистична обробка.