Методические указания. 1. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.

1. Зарисовать феномен бактериофагии на плотной питательной среде.

2. Для титрования бактериофага используются различные методы. Наиболее точным является метод агаровых слоев, предложенный Грациа. Сущность этого метода состоит в следующем.1,5%-ный МПА с генцианвиолетом (0,1 мл 0,1% генционвиолета на 1 л среды), который добавляется для предохранения от загрязнения грамположительной воздушной микрофлорой, накануне опыта разли­вают по 25-30 мл в чашки Петри. Чашки хорошо просушивают в термостате или под бактерицидной лампой, после чего оставляют на ночь при комнатной температуре.

Перед опытом 0,7% МПА расплавляют и разливают по 2,5 мл в пробирки, охлаждают до 46-47^°С и затем добавляют в пробирки по 1 мл исследуемого фага (предварительно разведенного) и 0,1 мл эталонной культуры, все это быстро и тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями, после чего выливают в чашки на поверх­ность 1,5% агара. Смесь осторожными движениями распределяют так, чтобы над слоем 1,5% агара образовался слои 0,7% агара, содержащего бактериофаг и чувствительную к нему культуру бактерий. Для застывания добавленного агара чашки оставляют на столе на 1-1,5 часа, а затем помещают в термостат при 37^°С . Для получения четких результатов необходимо соблюдение следующих условий: а) чашки с 1,5% агаром должны быть хорошо высушены; б) чашки должны находиться после добавления 0,7% агара строго в горизонтальном положении во избежание стекания агара в одну сторону; в) расплавленный 0,7% агар после охлаждения до 46°С нельзя долго хранить, так как он может приобрести гелеобразную консистенцию.

Учет результатов титрования можно производить после 5-6-часо­вого инкубирования в термостате. Для этого подсчитывают количество колоний фага («стерильных» пятен) и умножают полученное число на фактор разведения. На­пример, при посеве 1 мл фага, разведенного в 10^-7 на чашке обнаружено 45 колоний, следовательно, титр фага равен 45×10⁷ = 4,5×10⁸ Зарисовать демонстрационный опыт титрования фага по Грациа.

3. а) Опыт трансдукции.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиента Е. соli 1ас^- добавляют в таком же количестве трансдуцирующий фаг, выделенный из культуры Е. соli 1ас⁺, в концентрации 10⁶-10⁷ . Смесь инкубируют при 37^°С в течение часа, после чего 0,1 мл высевают на среду Эндо. В качестве контроля на среду Эндо высевают также культуру Е.соli lас⁺ (реципиент без фага). Посевы ставят на сутки в термостат. Учет результатов производят по числу выросших окрашенных колоний.

б) Опыт конъюгации.

Сущность опыта заключается в том, что от донорных клеток путем конъюгации передаются гены, контролирующие способность синтезировать треонин и лейцин, клеткам-реципиентам, ауксотрофным по этим аминокислотам.

В качестве донора используется культура Е. coli Hfr с генотипом tre⁺, lei⁺, met^-, str^s (str^s – чувствительность к стрептомицину). Реципиентом служит культура Е. coli F^– с генотипом tre^-, lei^-, met⁺, str^r (str^r - устойчивость к стрептомицину) .

Для выделения рекомбинантов используют солевую среду М-9 со стрептомицином, содержащую глюкозы 1,0 г; стрептомицина – 200 ед/мл; NH₄Cl – 1,0 г; NaС1 – 0,5 г; Na₂HРO₄ – 6,0 г; КH₂PO₄ – 3,0 г; Mg₂SO₄ – 0,2 г; дистиллированной воды – 1,0 л. Для тех же целей может быть испо­льзована плотная среда. В этом случае к указанному составу добавля­ется 20,0 г агар-агара.

На этой среде могут расти только рекомбинанты (трансконъюганты). Культуры донорного и реципиентного штаммов не растут на данной среде, так как первая ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а вторая ауксотрофна по треонину и лейцину.

Постановка опыта: к 2 мл 3-часовой бульонной культуры реципиен­та добавляют 1 мл 3-часовой бульонной культуры донора. Смесь инкубируют в течение 30 минут при 37°С. Затем смесь разводят в 100 и 1000 раз и засевают разведения в объеме 0,1 мл на селективную среду для выделения рекомбинантов. В качестве контроля на такую же среду засевают культуры донора и реципиента в том же объеме. На следующие сутки регистрируют результаты опыта. В пробирках с посевом рекомбинанта наблюдается помутнение среды. В средах с посевами донорной и реципиентной культур роста нет. Аналогичным образом регистрируют результаты посевов на плотных средах.

Просмотреть посевы культур донора, реципиента и рекомбинантов на минимальной среде со стрептомицином. Обратить внимание на рост культуры рекомбинантов. Культуры донора и реципиента не растут на данной среде, так как культура донора ауксотрофна по метионину и чувствительна к стрептомицину, а культура реципиента ауксотрофна по треонину и лейцину.

Контрольные вопросы

Что такое бактериофаг?

Каковы морфология, размеры и химический состав фагов?

Что содержится в головке бактериофага?

Как устроен хвостик фага и каково его назначение?

Из каких этапов складывается взаимодействие фага с микробной клеткой?

Каким образом фаг вводит свою нуклеиновую кислоту в микробную клетку?

Как осуществляется синтез фаговых частиц внутри микробной клетки?

Какая разница между вирулентным и умеренным фагом?

Что такое лизогения и лизогенная конверсия?

Как выделяют фаги из объектов внешней среды?

Какова методика определения титра фага по Грациа?

Что такое фаготипирование? С какой целью оно применяется?

Что такое ген?

Что таков мутации спонтанные и индуцированные?

Каков молекулярный механизм мутации?

Какие вы знаете мутагены?

Что такое ауксотрофы? Как получают ауксотрофные штаммы бактерий?

Каков механизм генетических рекомбинаций?

Что такое трансформация?

Что такое трансдукция и какими свойствами обладает трансдуцирующий фаг?

Что такое конъюгация бактерий? Как она осуществляется?

Как производят картирование хромосом?

Что такое плазмида?

Какие известны классы плазмид?

Каковы основные свойства плазмид?

Какие существуют типы генетического контроля лекарственной устойчивости у бактерий?

Каковы основные функций F-фактора?

В чем заключается механизм конъюгации бактерий?

Что такое бактериоцины?

Каковы основные свойства Соl -плазмид?

Какими свойствами обладают R-плазмиды?

Как определяют конъюгативные свойства плазмид?

Как получают рекомбинантные молекулы ДНК?

Что такое генетический вектор?

Как у бактерий можно обнаружить плазмиды?

В каких направлениях могут быть использованы достижения генной инженерии?