МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ
Белки под действием различных факторов (действие химических реагентов, нагревание и др.) легко подвергаются денатурации: происходит разрушение нативной структуры белков, приводящее к потере некоторых природных свойств, например, растворимости, биологической активности. Поэтому для выделения белков используют специальные приемы.
Процесс начинают с гомогенизациибиологического материала – измельчения до разрушения клеток и клеточных структур. Используют гомогенизаторы (пестиковые или ножевые), ультразвук, шаровые мельницы, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, метод «азотной бомбы».
Следующий этап - экстракция белков буферными смесями с определенными значениями рН, органическими растворителями. Большинство белков хорошо растворимо в 8-10% растворах солей.
Следующий этап - фракционированиеи очистка белков с использованием различных методов.
Высаливание – осаждение белков из раствора при добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов. Метод применяется в клинической практике при анализе белков сыворотки крови. Так проводят разделение глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении раствора сульфатом аммония) и альбуминов (осаждаются при 100% насыщении).
Электрофорез основан на различной подвижности белков в электрическом поле в зависимости от значений рН и ионной силы раствора. Используется в медицинской практике для анализа состава сыворотки крови, белковых и пептидных смесей.
Ультрацентрифугирование - метод разделения жидких дисперсных сред на компоненты под действием центробежной силы.
Хроматография - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент). В клинических лабораториях хроматографию применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.
Различают следующие виды хроматографии:
- адсорбционная– компоненты смеси разделяются в зависимости от их сорбируемости на твердом адсорбенте;
- распределительная - твердая фаза является опорой для стационарной жидкой фазы (бумажная хроматография);
- ионообменная - используют ионообменную смолу. Часть белков обменивается с функциональными группами ионообменной смолы и задерживается на колонке, в то время как другие белки элюируются из колонки;
- гель-хроматография или метод молекулярных сит позволяет разделить белки с разной молекулярной массой: небольшие молекулы проникают в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи и передвигаются вместе с подвижной фазой через хроматографическую колонку.
Перспективными видами хроматографии являются в настоящее время высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография.
Дата добавления: 2015-02-10; просмотров: 1117;