XIII. МЕХАНИЗМЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОК ПРИ ГИПОКСИИ

Главной мишенью при гипоксическом повреждении клеток являются мито-хондрии (Ю.А. Владимиров, 2001). Недостаток кислорода, определяющий снижение его напряжения в клетке ниже критического уровня, блокада дыхательной цепи и разобщение окислительного фосфорилирования приводят к формированию дефицита АТФ. В этих условиях в качестве компенсаторного механизма выступает активация гликолиза, выходящего из-под репрессивного влияния АТФ и стимулируемого продуктами его распада (АДФ, АМФ). Вместе с тем, такая компенсация не является равноценной. Во-первых, гликолиз не в состоянии ликвидировать дефицит АТФ. Во-вторых, активация гликолитического процесса носит непродолжительный характер. Ограничение гликолиза во времени обусловлено изменением реакции внутриклеточной среды (снижение рН) в связи с накоплением лактата. Поскольку центральный фермент гликолиза, регулирующий его интенсивность - фосфофруктокиназа обладает высокой чувствительностью к ацидозу, сдвиг рН в кислую сторону ингибирует ее активность, что приводит к торможению, а в конечном счете – к остановке гликолиза. Соответственно, падение АТФ в этом случае приобретает более выраженный и прогрессирующий характер.

В незрелых клетках фосфофруктокиназа представлена изоформами, менее чувствительными к ацидотическому ингибированию. Это обстоятельство лежит в основе повышенной устойчивости эмбриональных и фетальных тканей к острой гипоксии и обусловливает бóльшую выживаемость маленьких детей, по сравнению со взрослыми, при экстремальных состояниях, сопровождаемых острым кислородным голоданием (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 1999).

Наряду с угнетением гликолиза (после его временной активации) в клетке происходит ингибирование и других метаболических путей. Основу таких нарушений помимо дефицита макроэргов составляет накопление в митохондриях восстановленных кофакторов (НАДН и ФАДН), поскольку их переход в окисленную форму (НАД и ФАД) в условиях блокады транспорта электронов в дыхательной цепи оказывается невозможным (рис. 24).

Снижение содержания окисленных форм данных кофакторов определяет угнетение активности митохондриальных дегидрогеназ, включая дегидрогеназы цикла трикарбоновых кислот (изоцитратдегидрогеназа, α-кетоглутаратдегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа) и β-окисления жирных кислот (ацил-КоА-дегидрогеназа и β-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназа). Соответственно, возникает торможение этих метаболических процессов.

Следствием угнетения ЦТК становится некоторое повышение внутриклеточного пула ацетил-КоА, а угнетения β-окисления жирных кислот обусловливает прирост их содержания в цитоплазме клетки. В связи с особенностями происходящих нарушений клеточного метаболизма, этот ранний (и пока обратимый) этап патологических изменений клеток (в частности, в условиях ишемии), обозначен как «стадия ингибирования основных метаболических путей» (Меерсон Ф.З., 1984).

Очевидно, что угнетение биоэнергетической функции клетки сказывается на работе ее энергозависимых систем, в частности, 3Na⁺/2K⁺ АТФ-азы наружной клеточной мембраны, а также Са²⁺/ Mg²⁺ АТФ-азы саркоплазматического ретикулума (СПР) и наружной мембраны. В результате нарушения активности 3Na⁺/2K⁺ АТФ-азы происходит снижение градиента концентрации ионов по обе стороны мембраны, сопровождающееся усилением выхода ионов K⁺ из клеток во внеклеточную среду и падением мембранного потенциала (покоя). Отмеченные сдвиги имеют ряд следствий.

· Падение мембранного потенциала клеток, т.е. фактически их деполяризация вызывает открытие потенциалзависимых Na⁺ и Са²⁺ каналов.

· Открытие этих каналов обусловливает приток ионов Na⁺ и Са²⁺ в цитоплазму клеток из внеклеточного пространства.

· Выход ионов калия из клеток, подвергшихся гипоксическому воздействию, обеспечивает увеличение концентрации этих ионов в межклеточном пространстве, что снижает калиевый градиент по обе стороны мембраны, в том числе и для клеток, не находящихся в состоянии гипоксии. В результате нормальный ток ионов K⁺ через мембрану этих клеток окажется сниженным, что приведет к падению потенциала покоя и создаст возможность формирования потенциала действия в возбудимых тканях. Примером реализации такого «калиевого» механизма служит фибрилляция при ишемии миокарда, связанная с увеличением концентрации K⁺ в зоне инфаркта (Владимиров Ю.А., 2001).

· Длительная деполяризация клеточной мембраны выступает как один из механизмов торможения. Реализация такого торможения на уровне нейронов при глубокой гипоксии мозга, вызванной различными причинами (уремия, гиперосмолярная дегидратация, ацидоз, гипогликемия, отравление) приводит к развитию комы с потерей сознания и утратой рефлексов. Именно из-за своей гипоксической сути комы различной этиологии сходны по своим проявлениям (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 1999).

На фоне этих событий происходят существенные нарушения баланса ионов Na⁺ и Са²⁺,в первую очередь, возрастание их содержания в цитоплазме клеток. В нормальных условиях этот баланс поддерживается соотношением процессов поступления и выведения данных ионов из цитоплазмы (рис. 25), в том числе (для ионов кальция) и их перераспределением во внутриклеточные хранилища.

Рис. 25. Механизмы поддержания баланса ионов Na⁺ и Са²⁺ в клетке

В роли последних выступают митохондрии и саркоплазматический ретикулум В условиях гипоксии механизмы поступления ионов Na⁺ и Са²⁺ в цитоплазму усиливаются, а механизмы выведения – репрессируются (рис. 26).

Рис. 26. Механизмы повышения внутриклеточной концентрации

ионов Na⁺ и Са²⁺ при гипоксии

Так, рост внутриклеточной концентрации Na⁺ при гипоксии и складывающегося дефицита АТФ обусловлен не только снижением активности 3 Na⁺/2K⁺ АТФ-азы (рис. 26;а), откачивающей ионы натрия из клетки, но и активацией его транспорта в клетку вследствие открытия потенциалзависимых Na⁺ каналов (рис. 26; б). Кроме того, активируется еще один механизм поступления ионов натрия в клетку: Na⁺/H⁺ - обменник (в), как результат развития ацидоза и необходимости выведения из клетки ионов Н⁺ для поддержания нормальных значений внутриклеточного рН.

Следствием повышения содержания ионов натрия в цитоплазме является гипергидратация клетки, сопровождающаяся ее набуханием. Соответственно, будет происходить механическое (осмотическое) растяжение наружной клеточной мембраны, усугубляющее нарушение работы мембраносвязанных белков и повышающее ее проницаемость.

Аналогичные сдвиги процессов поступления и выведения реализуются и в отношении ионов Са²⁺. При этом поступление ионов кальция в цитоплазму складывается, по меньшей мере, из трех источников. Во-первых, в связи с открытием потенциалзависимых кальциевых каналов, осуществляется приток ионов кальция извне (1). Во-вторых, происходит выход ионов кальция из митохондрий (2), вследствие падения разности потенциалов на митохондриальной мембране. Такое падение определяет угнетение способности отрицательно заряженного электрического поля матрикса митохондрий удерживать кальций.

В-третьих, реализуется выход ионов кальция из СПР(3), индуцируемый активацией кальцием фосфолипазы С (ФЛС) и последующим рецепторно-опосредованным действием инозитолтрифосфата (ИФ₃) на мембрану СПР (CIRC - эффект). В то же время, аккумулирующая способность митохондрий в отношении кальция снижается (4), равно как и падает возможность закачивания кальция из цитоплазмы в СПР (5)или его выкачивание из клетки при участии Сa⁺/Mg²⁺- АТФ-азы (6) -дефицит энергии. Наконец, при повышении концентрации ионов натрия в примембранном пространстве цитоплазмы, ограничивается выведение из нее ионов кальция, осуществляемое при участии 3Na⁺/Са²⁺ обменника (7), поскольку в этих условиях дополнительное поступление Na⁺ в клетку лимитировано.

Оценивая последствия увеличения содержания Са²⁺ в цитоплазме клеток, прежде всего необходимо отметить, что он представляет собой универсальный вторичный мессенджер, модулирующий клеточные функции (Ткачук В.А., 2001; Ткачук В.А., Ратнер В.И., 2002). Взаимодействуя с внутриклеточными белками, ионы Са²⁺ регулируют их активность. Особая роль среди этих белков принадлежит кальмодулину, который, претерпевая конформационные изменения после связывания с Са²⁺ (активный кальмодулин), либо прямо, либо через кальмодулинзависимые протеинкиназы (Са МК) активирует ряд цитозольных ферментов (рис. 27). Среди них – мембраносвязанные фосфолипазы (ФЛ А₂, ФЛ С), NO-синтаза, кальций-зависимая АТФ-аза, киназа-фосфорилаза В, кальпаины, эндонуклеазы и др. В ходе регуляции с участием ионов Са²⁺ осуществляются сложные сетевые взаимодействия между различными сигнальными молекулами: кальций – оксид азота – цГМФ – протеинкиназа С (ПКС). Некоторые изоформы кальмодулинзависимых протеинкиназ способны обеспечивать стимуляцию протеинкиназы А (ПКА) с последующей активацией транскрипционного фактора CREB (сАMF – respons – element – binding).

Опосредованно активируя протеинкиназу С (ПКС), ионы Са²⁺ обусловливают фосфорилирование внутриклеточных белков, влияющих на разнообразные клеточные функции, включая метаболизм, пролиферацию и секрецию. Кроме того, под контролем ПКС находятся продукция антиапоптотического фактора bcl-2 и экспрессия гена MDR (multi-drang resistance), регулирующего устойчивость клеток к токсическим метаболитам.

Особая роль в реализации регуляторных эффектов кальция принадлежит Са²⁺-активируемым нейтральным цистеиновым (тиоловым) протеиназам – кальпаинам, представляющим собой одну из основных протеолитических систем клетки. Кальпаины обнаруживаются в цитоплазме в связи с мембранами. Они участвуют в ограниченном протеолизе рецепторных белков, некоторых ключевых ферментов обмена, белков цитоскелета, а также в расщеплении циклинов при митозе. Образующиеся в результате гидролиза белков под действием кальпаинов биологически активные пептиды также осуществляют свои регуляторные функции (сами или через каскады реакций), что обеспечивает перестройку метаболизма, лежащую в основе трансформации, деления, дифференцировки клеток и их адаптационных изменений.

Существенно, что такая плейотропная модифицирующая роль Са²⁺ проявляется лишь в условиях умеренного возрастания его концентрации (в пределах 10^-6 моль), тогда как дальнейшее наращивание внутриклеточного пула этого иона приводит к токсическому эффекту в виде повреждения клеточных структур. Именно поэтому выраженный избыток кальция в клетке (10^-6 – 10^-5 моль) представляет для нее опасность и рассматривается как один из ключевых механизмов клеточной гибели.

«Согласно современным патохимическим данным, важное отличие между ответом клеток на раздражение и повреждение заключается в том, что при реактивном раздражении стабилизация уровня кальция возможна, а при повреждении емкость стабилизирующих механизмов не достаточна и концентрация внутриклеточного кальция продолжает расти и сохраняться повышенной долго» (Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П., 1999).

Патогенетические последствия выраженного избытка Са²⁺ в цитоплазме проявляются повреждением клеточных мембран.

В этой связи необходимо отметить, что две основные функции мембран – барьерная и транспортная напрямую связаны с их динамическими свойствами, определяемыми подвижностью липидного бислоя. Липиды в мембранах ведут себя подобно жидким кристаллам, для которых характерно сочетание высокой упорядоченности с текучестью и лабильностью. В свою очередь жидкокристаллические (жидкостные) свойства мембран определяются тем, что липиды в них находятся при физиологической температуре в расплавленном состоянии. Температура плавления углеводородов тем ниже, чем больше двойных связей они содержат (этим определяется различие между животным и растительным маслами). Липиды, содержащие в углеводородных цепях двойные связи, плавятся при температурах ниже физиологических. В плазматических мембранах млекопитающих доля таких липидов велика. В результате вязкость этих мембран на 2-3 порядка выше вязкости воды и соответствуют вязкости растительного масла. Это позволяет ассоциированным с мембранами белкам, которые как бы плавают в «липидном море», менять свою конформацию, что является необходимым условием проявления их функциональной активности. Очевидно, что любые изменения, нарушающие баланс насыщенных и ненасыщенных липидов в клеточных мембранах, скажутся на функциях белковых молекул, встроенных в липидный бислой мембран, и мембран в целом (Волькенштейн М.В., 1988; Голенченко В.А., 2009).

Повреждающее действие на мембраны выраженного избытка кальцияреализуется с участием разных механизмов, среди которых ведущая роль отводится липидной триаде, включающей: А) активацию липаз и фосфолипаз; Б) детергентное действие избытка жирных кислот и лизофосфатидов; В) активацию перекисного окисления липидов (ПОЛ).