Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции
При диагностике ВИЧ-инфекции используется 4 группы методов:
1. Определение наличия вируса, его антигенов или копий РНК в материалах от больного или ВИЧ-инфицированного
2. Серологическая диагностика, основанная на выявлении специфических антител к поверхностным (gp 120 и gp 41) и внутренним (р 18 и р 24) белкам ВИЧ.
3. Выявление патогномоничнъгх (специфических) для ВИЧ-инфекции изменений в иммунной системе.
4. Лабораторная диагностика оппортунистических инфекций (СПИД-ассоциированных заболеваний).
1. Вирусологическая диагностика. Материалом для выделения ВИЧ являются Т-лимфоциты крови, лейкоциты костного мозга, лимфатические узлы, ткани мозга, слюна, сперма, спинномозговая жидкость, плазма крови. Полученным материалом заражают перевиваемую культуру Т-лимфоцитов (Н9). Индикацию ВИЧ в культуре клеток проводят по ЦПД (образование симпла-стов), а также методами иммунофлюоресценции, электронной микроскопии, по выраженной активности обратной транскриптазы. Современные методы исследования позволяют обнаружить один инфицированный лимфоцит на 1000 клеток.
Выявление вирусных антигенов в инфицированных Т-лимфоцитах осуществляют с помощью моноклональнъгх антител
В последние годы решающее значение для определения прогноза и тяжести ВИЧ-инфекции имеет определение количества копий РНК ВИЧ в плазме крови методом полимеразной цепной реакции (ТТЦР) - так называемая вирусная нагрузка. Если у пациентов, не получающих терапии, вирусная нагрузка находится ниже предела определения (это менее 5000 копий РНК ВИЧ в I мл плазмы), это свидетельствует об отсутствии прогрессирования или о медленном прогресси-ровании. Степень заразности при этом минимальная. Высокая вирусная нагрузка (более 10000 копий РНК в 1 мл плазмы) у пациентов с числом СО4-лимфоцитов менее 300 в 1 мкл всегда свидетельствует о прогрессировании болезни.
2. Серологическая диагностика. В настоящее время получила наибольшее распространение.
Материал для исследовать: 5 мл. гепаринизированной крови, которую до доставки в лабораторию можно хранить 6-8 часов в охлажденном, но не в замороженном состоянии.
С целью серологической диагностики СПИДа используют прежде всего методы иммуноферментного анализа со стандартными иммуноферментными системами (ИФА). Это скрининговый метод. Принцип работы основан на классическом принципе прямого ИФА. Иммуносорбентом являются полистироловые планшеты с иммобилизированным инактивированным вирусспецифиче-ским антигеном, полученным из ВИЧ, либо синтетическим путем. Затем вносят испытуемую сыворотку в разведении. Проводят инкубацию в лунках с антигеном. После связывания АГ с AT следует трехкратное отмывание несвязавшихся белков, а после этого в лунки вносят коньюгат антител к иммуноглобулинам человека с ферментной меткой. Образование специфического комплекса АГ+АТ выявляют внесением субстрата для фермента (раствор ортофенилендиамина и перекиси водорода). В результате окраска среды меняется пропорционально количеству антител. Результаты исследования учитывают на спектрофотометре. Сыворотки крови, имеющие вирусспецифические антитела по данным ИФА, в дальнейшем необходимо исследовать методом иммунного блотинга.
Иммунный блотипг является подтверждающим тестом, так как позволяет выявить антитела к различным белкам ВИЧ. Он основан на предварительном фракционировании по молекулярной массе (разделении) белков ВИЧ электрофорезом в полиакриламидном геле с последующим перенесением антигенов на мембрану из нитроцеллюлозы. Затем на мембрану наносится испытуемая сыворотка. При этом специфические антитела образуют комплекс с конкретным АГ (gp.120, gp.41, p.24, p.18). Заключительный этап исследования - выявление антител к различным белкам ВИЧ. Для этого в систему добавляют антитела против белков человека, меченые ферментом или радиоизотопной меткой. Таким образом, в сыворотке пациента выявляют (либо не выявляют) вирусспецифические антитела ко всем или большинству антигенов ВИЧ.
3. Исследования иммунного статуса. Направлены на выявление:
1) уменьшения соотношения CD4/CD8 клеток (в N 2 и >, при СПИДе - 0,5 и <);
2) снижения содержания CD4 клеток (<200 клеток/мл.);
3) наличия одного из лабораторных признаков, включающих анемию, лейкопению, тромбошггопению, лимфопению;
4) повышения концентрации Ig А и Ig G в сыворотке крови;
5) снижения реакции бластгрансформации лимфоцитов на митогены;
6) отсутствие кожной реакции ГТЗ на несколько антигенов;
7) повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов.
Дата добавления: 2015-01-19; просмотров: 1301;