РАЗДЕЛЕНИЕ СВЯЗАННОГО И СВОБОДНОГО ГОРМОНА

Существуют различные способы разделения связанного с антите­лами и свободного гормона. В системах для полипептидных гормо­нов обычно применяют «методику вторых антител». Поскольку исходный комплекс гормона с антителом растворим, с помощью простого центрифугирования разделить связанный и свободный гормон невозможно. В связи с этим после достижения равновесия между гормоном и первыми антителами добавляют вторые антите­ла, полученные на g-глобулин животного того вида, у которого получали первые антитела. Поскольку вторые антитела будут те­перь связывать образовавшийся комплекс между гормоном и пер­выми антителами, то возникнет вторичный нерастворимый моле­кулярный комплекс, и связанный свободный гормон можно будет отделить простым центрифугированием. Например, если антите­ла к гастрину вырабатывались у кролика, то вторые антитела к кроличьему g-глобулину следовало бы получать у животного дру­гого вида (лошади, овцы или козы). Лошадиный антикроличий глобулин нужно было бы добавить в пробирку для анализа после установления равновесия в реакционной смеси, содержащей мечен­ный ^125I гастрин и кроличью антигастриновую сыворотку. Время, необходимое для установления равновесия реакции со вторыми антителами, зависит от концентрации кроличьей сыворотки-носи­теля в реакционной смеси. Например, если первые антитела к гас­трину получены от кролика, в пробирку для анализа можно допол­нительно добавить кроличью сыворотку-носитель или глобулин. Если кроличья сыворотка-носитель занимает 2% объема пробир­ки, то для осаждения кроличьего g-глобулина следует добавлять относительно большой объем вторых антител (0,05—0,2 мл). Поскольку равновесие достигается за время, определяемое первым законом действующих масс, то оно должно достигаться относи­тельно быстро (за несколько часов). Это время вначале находят эмпирически и подбирают необходимый наименьший оптимальный объем вторых антител для каждой их партии, получаемой в лабо­ратории или от торговых фирм. В пробирки для анализа можно добавлять меньшие концентрации сыворотки- носителя, что умень­шит необходимый объем вторых антител, но увеличит время, тре­буемое для достижения равновесия реакции с их участием.