Умови гемаглютинації деяких вірусів

Як правило, гемаглютинуючі властивості збудників вірусних інфекцій забезпечуються їхнім структурним білком, що у простих вірусів (без зовнішньої оболонки) входить до складу капсиду, а у вірусів, які мають суперкапсид, є гліко- або ліпопротеїдом оболонки. Цей білок називають гемаглютиніном. Наявність гемаглютинуючої активності не є показником інфекційних властивостей вірусу.

Наприклад, гемаглютинін вірусу грипу являє собою глікопротеїд, розташований на поверхні віріону у вигляді чисельних коротких виступів. Вірус може прикріплюватися до еритроцитів, що володіють комплементарними рецепторами, створюючи тривимірні структури, що складаються з «склеєних» між собою еритроцитів. Можливо, віруси, адсорбовані на поверхні еритроцитів, змінюють їхній заряд, унаслідок чого еритроцити набувають здатності склеюватися, осідаючи на дно пробірки або лунки планшета тонкою плівкою у вигляді перевернутої парасольки (картина повної гемаглютинації).

Гемаглютинація вірусів грипу, параміксовірусів, ускладнюється тим, що крім гемаглютиніну віріони містять також фермент нейрамінідазу, що руйнує глікопротеїдні рецептори на поверхні еритроцитів, що приводить до десорбції вірусу з поверхні еритроцита. Якщо реакцію проводити при +4^оС (температурі занадто низкій для дії ферменту), то десорбції не відбувається. Для видимої аглютинації курячих еритроцитів (звичайно 0,25 мл 1%-вої суспензії) потрібно близько 10⁷ віріонів вірусу грипу. Отже, реакція гемаглютинації не настільки чутлива, щоб уловити невеликі кількості вірусу, однак вона дуже проста, що робить її зручної при наявності великих кількостей вірусу.

Гемаглютинуючий титр вірусу – це його найбільше розведення, що дає картину повної гемаглютинації. Видову належність аглютинованих еритроцитів нерідко використовують для індикації вірусів. Так, віруси грипу типів А і В аглютинують еритроцити курей, морських свинок, людини з 0 групою крові, а віруси грипу типу С – лише еритроцити курей та людини. Більшість параміксовірусів також аглютинують еритроцити курей, людини і морських свинок, але вірус кору, що до них належить, - лише еритроцити мавп.

Під час постановки РГА доцільніше використовувати еритроцити птахів, а не ссавців, оскільки пташині дають чіткіший результат, швидше осідають і рідко аглютинують спонтанно.

Про специфічність вірусної гемаглютинації роблять висновок за ефектом гальмування або пригнічення її відповідними противірусними антитілами. Це явище знаходиться у основі реакції гальмування гемаглютинації (РГГА). Механізм РГГА полягає в тому, що специфічні противірусні антигемаглютиніни перешкоджають вірусам аглютинувати еритроцити чутливих видів тварин.

РГГА застосовується у вірусології для ідентифікації гемаглютинуючих вірусів, серологічної діагностики вірусних інфекцій (за приростом титру антитіл або за роздільним визначенням Ig), контролю рівня імунітету та масових екологічних досліджень.

РГГА – трикомпонентна серологічна реакція, що крім специфічно взаємодіючих антигену та антитіла має індикатор імунологічної реакції – еритроцити. Реакцію проводять у тих же самих умовах (електролітне середовище, його рН, температура), у тому самому об'ємі і з еритроцитами того самого виду, що й РГА цього вірусного антигену.

Позитивним у РГГА є простота і доступність методики, економічність, можливість визначення в умовах декількох інфекцій (наприклад, при грипі) штамову специфічність гемаглютининів і антитіл до них.

Основним недоліком РГГА є вплив на результат неспецифічних інгібіторів гемаглютинації, що містяться у нормальних сироватках крові людини й тварин.

3.10. Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА або РПГА)

Феномен непрямої (пасивної) гемаглютинації ґрунтується на склеюванні – аглютинації навантажених антигеном еритроцитів сироватками, що мають специфічні антитела до антигену.

Для отримання феномену аглютинації антиген попередньо адсорбують на корпускулярному носії, за котрий служать інертні частки (латекс, оксид барію, бентоніт). Якщо адсорбентом є еритроцити (баранячі, курячі, О-групи людини), реакція носить назву пасивної (непрямої) гемаглютинації. Антигени полісахаридної природи добре адсорбуються еритроцитами без додаткової обробки. При використанні антигенів білкової природи необхідна додаткова обробка еритроцитів таніном для підвищення їх адсорбційних властивостей.

Спостереженнями ряду авторів установлено, що РНГА (РПГА) за чутливістю значно перевищує РГА та дозволяє виявити мінімальні кількості антитіл та антигенів. При стандартизації реагентів та умов проведення реакції можна виявити 3-6 нг азоту антитіл у 1 мл.

У клінічній практиці РНГА (РПГА) використовують для виявлення:

- аутоантитіл, зокрема, ревматоїдного фактору IgM-антитіл проти гама-глобулінів;

- HBs-антигену вірусу гепатиту В у епідеміологічних дослідженнях і для оцінки донорської крові.

3.11. Реакція гемадсорбції (РГ_адс) та реакція гальмування гемадсорбції (РГГ_адс)

Реакція гемадсорбції – це здатність клітин, інфікованих вірусом, адсорбувати на своїй поверхні еритроцити. Ця реакція характерна для представників родин вірусів, що мають гемаглютинін у складі суперкапсидної оболонки (родини Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae). Проба, яка відображає зміни метаболізму клітин у процесі репродукції у них вірусу, що впливає на показники рН культурального середовища.

Основою реакції є феномен гемадсорбції, тобто прикріплення еритроцитів до поверхні модифікованої вірусними глікопротеїнами клітинної оболонки. Складнопобудовані віруси, що мають гемаглютинуючі властивості, як правило, здатні до ефекту гемадсорбції. Гемадсорбція широко застосовується у вірусологічній практиці для індикації вірусів у культурі клітин, особливо у тих випадках, коли цитопатичні зміни недостатньо виражені і виявлення їх у світловому мікроскопі неможливе.

Реакцію спостерігають за допомогою світлового мікроскопа. У разі позитивної РГ_адс у полі зору виявляються клітини, ”посипані зерном”, тобто з еритроцитами на клітинній оболонці.

РГГ_адс – серологічна реакція, що застосовується для ідентифікації вірусів, які не вдається типізувати іншими методами. При цьому специфічні сироватки, використані для гальмування гемадсорбції, обов'язково обробляють рецепторруйнівним ензимом, шляхом температурного впливу або іншими методами, що звільняють сироватки від неспецифічних інгібіторів гемаглютинації.

У багатьох випадках ефект гемадсорбції може бути застосований для обліку реакції нейтралізації (РН), коли дію сироватки, нейтралізуючу вірус, визначають за відсутністю гемадсорбції.

3.12. МОЛЕКУЛЯРНО-ГІБРІДОЛОГІЧНІ МЕТОДИ

Певну послідовність нуклеотидів, що складає генетичну інформацію, можна ідентифікувати з абсолютною специфічністю шляхом гібридизації з комплементарною копією, використовуючи як зонд нуклеїнову кислоту, позначену радіоактивною міткою або кон’юговану іншим способом. Розвиток технології виробництва рекомбінантних ДНК і методів хімічного синтезу нуклеїнових кислот дав змогу одержувати зонди будь-якої специфічності. За допомогою методу стало можливо виявити РНК і ДНК збудника інфекції у клінічному матеріалі (кров, виділення з носової частини глотки, слина, кал, матеріал, одержаний під час біопсії тощо). Цей метод незамінний для ідентифікації вірусів, що не культивуються у лабораторних умовах, для персистуючих вірусів, для виявлення провірусу (вірусспецифічної інфекційної послідовності в клітинному геномі). За допомогою молекулярної гібридизації було виявлено кишкові аденовіруси (типи 40, 41) у калі, віруси папіломи у клітинах пухлин (рак шийки матки) та інши збудники інфекцій, визначено їх типи і варіанти.

Принцип методу полягає у наступному. Молекула клітинної ДНК складається з двох ланцюгів, зв’язаних водневими зв’язками. Під час нагрівання при температурі 100^оС або обробки лугом водного розчину ДНК водневі зв’язки руйнуються, і подвійна спіраль дисоціює на два окремі ланцюжки. Цей процес називається денатурацією ДНК. Проте у разі тривалої експозиції при температурі 65^оС одноланцюжкові ДНК можуль легко утворити дволанцюжкову спіраль, ідентичну вихідній; такий процес називається ренатурацією або гібридизацією. Реакція гібридизації може відбуватися між будь-якими двома одноланцюжковими нуклеїновими кислотами (ДНК-ДНК, ДНК-РНК, РНК-РНК) за умови, якщо вони мають комплементарні нуклеїнові послідовності.

Один з ланцюжків можна позначити маркером, і за допомогою цього ланцюжка виявляти в досліджуваному матеріалі комплементарні йому послідовності.

Швидкість реасоціації залежить від багатьох умов, з них найважливішими є температура реакції та іонна сила розчину. Температура, при якій половина молекул нуклеїнової кислоти перебуває у дволанцюжковій формі, називається температурою плавлення. Реакція гібридизації має широкий температурний оптимум – від 30^оС до 15^оС, що нижче за температуру плавлення. Оптимально реакція відбувається при 0,4М Na⁺. На швидкість реакції впливає також в’язкість і рН розчину, кількість пар основ у дуплексі, концентрація формаміду в розчині тощо. Від цих самих умов залежить утворення стабільних гібридів і, отже, специфічність реакції.

Найбільш зручним і простим методом є гібридизація ДНК або РНК, імобілізованих на нерозчинному носії. У такому випадку нуклеїнова кислота, що аналізується, у одноланцюговій формі закріплюється на носії. До неї додають одноланцюжкові мічені зонди. Якщо утворюються гібриди, то вони ідентифікуються на носії (нітроцелюлозний фільтр), а негибридізовані молекули РНК (ДНК) зондів відмиваються з носія. Швидкість гібридизації дає змогу зробити висновок про ступінь гомологічності двох молекул нуклеїнової кислоти, оскільки гібридизуються тільки комплементарні послідовності.

Нарізаючи ДНК або РНК ферментами, можна одержати олігонуклеотиди, які розділяють шляхом електрофорезу у агарозі або поліакріламідному гелі, а потім переносять на нітроцелюлозні фільтри (блот-гібридизація, або блотінг за Саузерном), і до кожного фрагменту додають мічений зонд для визначення ступеня гомології.

Зонди. Зондами називають РНК і ДНК, за допомогою яких у досліджуваному матеріалі виявляють комплементарні нитки. Для одержання зонду можна використовувати нуклеїнову кислоту, виділену з віріонів, або РНК, одержані шляхом транскрипції in vitro. Проте найдешевшим зондом є клонована рекомбінантна ДНК. Зонди мітять радіоактивними попередниками (звичайно радіоактивним фосфором) у реакції, що називається нік-трансляцією. Ця реакція основана на розривах нитки ДНК ендонуклеазою і одночасному ковалентному приєднанні до кінців розривів нуклеотидів, мічених радіоактивним фосфором (за допомогою кінцевої нуклеотидилтрансферази). Складністю цього методу є короткий період напіврозпаду радіоактивного фосфору та необхідність мати спеціальне обладнання для виявлення радіоактивності. Тому перспективнішим є застосування калориметричних реакцій. Для цього у молекулу зонда під час нік-трансляції вводять біотин, що може міцно зв’язувати авудин або стрептовірудин, у свою чергу вони зв’язані з ферментом (пероксидазою або лужною фосфатазою). У разі додавання до такого зонду субстрату виникає забарвлення, помітне неозброєним оком.

Існує кілька варіантів методу гібридизації: на фільтрах, точкова гібридизація, блот, сендвіч-, in situ, пряма у гелі та ін.

Точкова гібридизація дає змогу одночасно використовувати багато клінічних проб. На стандартні фільтри наносять виділені з проб ДНК і РНК. Якщо наявні двонитчасті структури, їх денатурують і після цього додають зонд. Метод використовують для виявлення вірусів цитомегалії, гепатиту В, рота-, ентеро-, парвовірусів, вірусів герпесу, грипу тощо.

Блот-гібридизація (від англ. blot – пляма) – метод виявлення фрагментів ДНК, розділених шляхом електрофорезу в агарозі. При цьому виділену з тканин та очищену ДНК нарізають рестрикційними ендонуклеазами на фрагменти. Після електрофорезу ці фрагменти переносять з агарози на нітроцелюлозні фільтри, на які наносять мічений зонд. Метод дозволяє визначити кількість вірусспецифічних послідовностей у виділених з клітин ДНК. Застосовується він і для виявлення в пухлинній тканині геномів вірусів інфекційного мононуклеозу, Епштейна-Барр, папіломи людини тощо.

Аналогічний метод можна застосовувати і для виявлення фрагментів РНК, проте його рідко використовують у діагностичній вірусології.

Сендвіч-гібридизація грунтується на використанні двох клонованих неідентичних фрагментів ДНК, один з яких імобілізований на фільтрі, а другий є зондом. Наявна у пробі комплементарна нитка гібридизується з обома нитками ДНК і зв’язує зонд з фільтром. Цей високочутливий метод дає змогу використовувати пробу без попередньої обробки. Його використовують для виявлення вірусів у виділеннях з носової частини глотки, вірусу цитомегалії в сечі тощо.

Гібридизацію in situ у заражених тканинах використовують для вивчення персистентних інфекцій та злоякісних пухлин у разі інфекцій, спричинених вірусами гепатиту В, простого герпесу, інфекційного мононуклеозу тощо. При цьому використовують заморожені зрізи тканини, одержаної під час біопсії, та інші матеріали.

Реакція молекулярної гібридизації є високочутливою, вона дає змогу в оптимальних умовах виявити нуклеїнові кислоти у таких низьких концентраціях, як 1-10 пг. Проте чутливість методу часто недостатня для виявлення вірусних послідовностей, якщо заражено небагато клітин у організмі. Наприклад, за умови ВІЛ-інфекції провірус звичайно знаходять лише в одному з 10⁵-10⁶ Т-лімфоцитів. У такому разі проводять попередню ампліфікацію вірусних нуклеїнових кислот шляхом додавання РНК затравки, комплементарної певним ділянкам обох ниток ДНК у консервативній ділянці молекули, і потім ідентифікують ДНК за допомогою зонда.

Полімеразна ланцюгова реакція

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), або метод ампліфікації генів, дає змогу розмножувати задані ланцюжки ДНК у значній препаративній кількості. Вона може бути застосована також для індикації специфічних ДНК у судово-медичному дослідженні, в лабораторній діагностичній практиці, у тому числі в бактеріології та вірусології. Мова іде про індикацію тих нуклеїнових кислот, структура яких вивчена.

В основу ПЛР покладено відкриття ферменту ДНК-полімерази, розробка методу секвенування молекули ДНК, а також синтез олігонуклеотидів різної довжини та специфічності (праймерів).

ДНК-полімераза здатна подовжити короткі олігонуклеотидні затравки (праймери), додаючи до їх 3’-кінця наступний, додатковий, нуклеотид. Для цього необхідний праймер, гібридизований з комплементарним ланцюгом ДНК, яка є матрицею. Як правило, пошук ДНК-матриці і є завданням ПЛР.

Розчин, де відбувається ПЛР, має містити в достатній кількості нуклеотиди, ДНК-полімеразу, специфічні олігонуклеотиди й клінічний матеріал, у вигляді виділеної з нього ДНК. Усі ці компоненти ПЛР утримують в одній пробірці, температурний режим їх послідовно змінюють. Так, у разі діагностики ВІЛ-інфекції:

- при 94^оС відбувається денатурація досліджуваної ДНК;

- при 37 ^оС до обох розплетених ниток за принципом комплементарності приєднуються затравки (процес “відпалювання праймерів”);

- при 72 ^оС tag-ДНК-полімераза (фермент отримано з термофільних бактерій Thermophylus aguaticus) подовжує праймери до заданого розміру вірусного геному.

Як результат у пробірці замість 2 ниток вірусної ДНК з’являються 4. Цикл повторюють, кількість копій вірусу знову подвоюються і так далі. За 40 циклів ампліфікації кількість копій ДНК збільшується в 10¹³ разів. Таку кількість ДНК вірусу тепер можна ідентифікувати будь-яким відомим методом (наприклад, за допомогою електрофорезу в поліакріламідному гелі – ПААГ).