Биосинтез витамина В12
Витамин В12, или цианкобаламин, — важное биологическое соединение, активный гематопоэтический фактор млекопитающих и ростовой фактор для многих видов микроорганизмов и животных.
Химический синтез витамина В12 очень сложен. Больше 10 лет потребовалось сотрудникам двух больших лабораторий — Вудворта и Эшенмозера для осуществления химического синтеза витамина В12, включающего 70 стадий. Поэтому в настоящее время витамин В12 в промышленности получают исключительно биосинтетическим путем. Из 10 тонн ежегодно выпускаемого в мире витамина B12 3,5 т приходится на цианкобаламин (собственно витамин B12), 2 т на гидроксокобаламин, 1т — на коэнзим В]2 и небольшое количество на метилкобаламин; эти формы в указанных количествах используют в медицине. Остальное количество витамина используется для животноводства.
В настоящее время для получения витамина В12 используют следующие микроорганизмы Prop, freudenreichii ATCC 6207, Prop, shermanii ATCC 13673, Prop, shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Поскольку синтез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществляют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1-й стадии культуру выращивают в анаэробных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ и превращения этиокобаламнна в дезоксикобаламин. Обе стадии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Анаэробно выросшие клетки можно собрать путем центрифугирования и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида. Добавление ДМБ производят только во 2-й стадии ферментации (если бактерии не синтезируют его самостоятельно), поскольку в его присутствии образуются полные формы витамина, ингибирующие его синтез. Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную-мелассу (10—100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также Со (10—100 мг/л), источники азота [(Nl-UhSCU]. В среду добавляют кукурузный экстракт (30—70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез витамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно. Бактерии-культивируют при 30°, поддерживая рН на уровне 6,5—7,0 путем введения (NH4)OH. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевного материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим давлением N2 и слабым перемешиванием (без аэрации), в следующие 88 ч включают аэрацию (2 м3/ч) и перемешивание. Возможны некоторые вариации в культивировании. Витамин В12 сохраняется в клетках бактерий, поэтому проводят его экстракцию:
1) выделение витамина из клеток и превращение его в цианокобаламин;
2) выделение неочищенного продукта (80% чистоты), который можно использовать в животноводстве;
3) дальнейшую очистку до уровня 91—98% (для медицинских целей).
Для экстракции витамина из клеток последние нагревают при 80°—120° в течение 10—30 мин при рН 6,1—8,5. Превращение в CN-кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или клеточную суспензию цианидом или тиоционатом, часто в присутствии NaNO2 или хлорамина В. Корриноиды сорбируют на различных носителях: амберлите IRC-50, А12О3, активированном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями. Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом или смесью этих спиртов с бензином, бутанолом, углеродистым тетрахлоридом или хлороформом.
При упаривании различных растворителей получают осадок или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем растворителе до нужной концентрации.
Выход витамина B12 при использовании пропиоиовокислых бактерий - 25—40 мг/л. Но есть патентное сообщение (Франция) о достижении невероятно высокого выхода — 216 мг/л.
Дата добавления: 2014-12-17; просмотров: 2038;