Биосинтез витамина В12

Витамин В12, или цианкобаламин, — важное биологическое соединение, активный гематопоэтический фактор млекопитающих и ростовой фактор для многих видов микроорганизмов и животных.

Химический синтез витамина В12 очень сложен. Больше 10 лет потребовалось сотрудникам двух больших лабораторий — Вудворта и Эшенмозера для осуще­ствления химического синтеза витамина В12, включающего 70 стадий. Поэтому в настоящее время витамин В12 в промышленности получают исключительно биосинтетическим путем. Из 10 тонн ежегодно выпускаемого в мире витамина B12 3,5 т приходится на цианкобаламин (собственно ви­тамин B12), 2 т на гидроксокобаламин, 1т — на коэнзим В]2 и небольшое количество на метилкобаламин; эти формы в указанных количествах используют в медицине. Остальное количество витамина используется для животноводства.

В настоящее время для получения витамина В12 используют следующие микроорганизмы Prop, freudenreichii ATCC 6207, Prop, shermanii ATCC 13673, Prop, shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты. Наибольший интерес представляют штаммы, способные к самостоятельному синтезу 5,6 ДМБ. Поскольку син­тез 5,6 ДМБ лучше происходит при доступе воздуха, осуществля­ют двустадийный процесс, в котором получают наиболее высокий выход продукта. На 1-й стадии культуру выращивают в анаэроб­ных условиях до полной утилизации сахара. На 2-й стадии включают аэрацию, тем самым создавая условия для синтеза 5,6 ДМБ и превращения этиокобаламнна в дезоксикобаламин. Обе ста­дии осуществляют в двух разных ферментерах или в одном. Ана­эробно выросшие клетки можно собрать путем центрифугирова­ния и инкубировать густую суспензию на воздухе и, если нужно, в присутствии 5,6 ДМБ и цианида. Добавление ДМБ производят только во 2-й стадии ферментации (если бактерии не синтезиру­ют его самостоятельно), поскольку в его присутствии образуются полные формы витамина, ингибирующие его синтез. Среда для ферментации обычно содержит глюкозу или инвертированную-мелассу (10—100 г/л), небольшие количества солей Fe, Mn и Mg, а также Со (10—100 мг/л), источники азота [(Nl-UhSCU]. В среду добавляют кукурузный экстракт (30—70 г/л), содержащий молочную и пантотеновую кислоты, усиливающие рост бактерий. Пантотеновую кислоту, стимулирующую также синтез ви­тамина, рекомендуют вносить в среду дополнительно. Бактерии-культивируют при 30°, поддерживая рН на уровне 6,5—7,0 путем введения (NH4)OH. Ферментацию производят в ферментерах на 500 л, содержащих 340 л среды, инокулированных 7 л посевно­го материала. В первые 80 ч культура растет под небольшим дав­лением N2 и слабым перемешиванием (без аэрации), в следую­щие 88 ч включают аэрацию (2 м3/ч) и перемешивание. Возмож­ны некоторые вариации в культивировании. Витамин В12 сохраняется в клетках бактерий, поэтому проводят его экстракцию:

1) выделение витамина из клеток и превращение его в цианокобаламин;

2) выделение неочищенного продукта (80% чистоты), ко­торый можно использовать в животноводстве;

3) дальнейшую очистку до уровня 91—98% (для медицинских целей).

Для экстракции витамина из клеток последние нагревают при 80°—120° в течение 10—30 мин при рН 6,1—8,5. Превращение в CN-кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или кле­точную суспензию цианидом или тиоционатом, часто в присутст­вии NaNO2 или хлорамина В. Корриноиды сорбируют на различ­ных носителях: амберлите IRC-50, А12О3, активированном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями. Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом или смесью этих спиртов с бензином, бутанолом, углеродистым тетрахлоридом или хлороформом.

При упаривании различных растворителей получают осадок или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем растворителе до нужной концентрации.

Выход витамина B12 при использовании пропиоиовокислых бактерий - 25—40 мг/л. Но есть патентное сообщение (Франция) о достижении невероятно высокого выхода — 216 мг/л.