Генна інженерія. Біотехнологія

Генна інженерія — галузь молекулярної генетики, завдання якої — конструювати генетичні структури за заздалегідь намі­ченим планом, створювати організми з новою генетичною про­грамою. Виникнення генної інженерії стало можливим завдяки синтезу ідей і методів молекулярної біології, генетики, біохімії і мікробіології. Основні принципи генної інженерії були розробле­ні в 60—70-х роках XX ст. Вони включали три основних етапи: а) отримання генетичного матеріалу (штучний синтез або виділен­ня природних генів); б) включення цих генів у генетичну структу­ру, яка реплікується автономно (векторну молекулу ДНК), тобто створення рекомбінантної молекули ДНК; в) введення векторної молекули (із включенням у неї генома) у клітину-реципієнта, де вона вмонтовується в хромосомних апаратах.

Експериментальне перенесення генів в інший геном назива­ється трансгенезом. Він ґрунтується на технології рекомбінант­ної ДНК. В основі генної інженерії лежать різні методи маніпуля­цій із молекулами ДНК.

Отримання генетичного матеріалу

У сучасній генетиці використовують два способи синтезу ге­нів поза організмом — хімічний і ферментативний. Для хімічно­го синтезу необхідно мати повністю розшифровану послідовність нуклеотидів ДНК. Уперше штучний ген синтезував індійський вчений Г. Коран (1970). Це був ген аланінової тРНК дріжджів, який складався із 77 нуклеотидів. У перших дослідах він не вияв­ляв функціональної активності, бо не мав регуляторних ділянок. У 1976 р. вдалося синтезувати ген тирозинової тРНК кишкової палички, який складається не тільки зі структурної ділянки (126 нуклеотидних пар), а й регуляторних частин — промотора і тер­мінатора. Цей штучно створений за спеціальною програмою ген був трансплантований у бактеріальну клітину і функціонував як природний.

Іншим прикладом хімічного синтезу є синтез гена, який кодує фермент розщеплення лактози. Синтезований у пробірці ген був умонтований у плазміду і введений у бактерію; кишкова палич­ка набула здатності засвоювати лактозу. Проте хімічним шляхом можна синтезувати невеликі за розміром гени прокаріотів. Син­тез генів еукаріотів, які складаються з тисячі й більше нуклеоти-дів, шляхом хімічного синтезу створити поки що не вдалося.

Ферментативний синтез генів здійснюють за допомогою про­цесу зворотної транскрипції. Відкриття цього процесу зроблено на пухлиноутворювальних РНК-умісних вірусах. Проте згодом виявилося, що передавання генетичної інформації з іРНК на ДНК може відбуватися в умовах експерименту і з іншими РНК. Саме це лежить в основі ферментативного синтезу гена. Спрощено це можна подати так: у пробірці на матриці ІРНК за допомогою фер­менту зворотної транскриптази (ревертази) синтезується компле­ментарна до неї нитка ДНК, потім утворюється двониткова моле­кула ДНК. Після цього іРНК руйнується ферментом рибонуклеа­зою, отриману ДНК називають ДНК-копією (кДНК). Така кДНК не має вставок-інтронів, тобто схема її будови не відрізняється від бактеріального гена.

Матричну (інформаційну) РНК (мРНК) виділяють із клітин або тканин, в яких експресується потрібний ген. Так, для клону-вання проінсулінового гена використовують Р-клітини підшлун­кової залози, тому саме для них характерний високий вміст про-інсулінової мРНК.

Ген, отриманий внаслідок ферментативного синтезу, може функціонувати в бактеріальній клітині. На ньому синтезується іРНК, а потім білок. Під керівництвом В. Енгельгарда був отри­маний ген, який визначає синтез ферменту галактозидази. Цей ген вводили у фаг, при розмноженні якого в клітині одержали безліч копій, що забезпечило синтез великої кількості ферменту. Це має не тільки теоретичне, а й практичне значення, тому що галактозидаза застосовується в харчовій промисловості.

Синтезовано гени глобіну людини, кроля, голуба, деякі гени мітохондрій, печінки, пацюків і багато інших.

Гени, синтезовані за допомогою ревертази, не мають регуля­торної частини і промотора. Відсутність регуляторних ділянок перешкоджає функціонуванню цих штучних генів у тваринних клітинах. При перенесенні в мікробну клітину до структурних ге­нів експериментально, за допомогою ферментів, приєднують про­мотор, який добувають з мікробної клітини. Так були синтезовані два гени, відповідальні за синтез ланцюгів інсуліну. їх вводили в геном кишкової палички, яка почала продукувати інсулін. Важ­ливим досягненням генної інженерії є синтез гена соматостатину, який може функціонувати в мікробній клітині. Таким же мето­дом під керівництвом Ю.О. Овчиннікова і М.П. Дубініна здій­снено синтез генів, які кодують нейрогормони людини (лейцин-енкефалін і брадикінін).

Ферментативний синтез генів має велике значення, тому що принципово можливо проводити штучний синтез будь-яких інди­відуальних генів шляхом транскрипції їх із відповідних матрич­них РНК. Основною перешкодою є синтез не структурних, а регу­ляторних частин генів, необхідних для їх нормальної роботи. Це здебільшого обмежує використання штучно синтезованих генів.

У генній інженерії широко використовують так само і виді­лення природних генів з метою створення рекомбінативних мо­лекул днк.

Включення отриманого гена у вектор. Вектор це щось по­дібне до молекулярного "таксі", здатного переносити чужу ДНК всередину бактеріальної клітини таким чином, щоб вона там змо­гла реплікуватися. Існує два основні типи векторів: бактеріальні плазміди і бактеріофаги.

Після виділення або синтезу гена його зшивають з векторною (спрямовуючою) молекулою ДНК. Для цього використовують осо­бливі бактеріальні ферменти. Такі ферменти є в бактерій, у яких вони зупиняють репродукцію вірусу, вирізаючи вірусну ДНК із геному бактерії. Вони називаються рестриктазами, оскільки об­межують розмноження вірусів. Кожен тип ферментів рестрикції (а їх відомо близько 100) розділяє ДНК у специфічному місці, що називається сайтом рестрикції.

У проміжку, що з'явився, може бути розміщена ділянка чужо­рідної ДНК. Таку ДНК можна розрізати за допомогою того самого ферменту рестрикції. Одноланцюгові комплементарні кінці двох ДНК називають "липкими кінцями", тому що вони з'єднуються внаслідок комплементарного спарювання азотистих основ. Вони полегшують вставлення чужорідної ДНК у векторну.

Таким чином, можна поєднувати відрізки ДНК, отримані з різ­них джерел, і створювати комбінації генів в одній довгій молеку­лі. Оскільки водневі зв'язки легко розриваються, для з'єднання ділянок застосовують фермент лігазу — один із ферментів репа­рації. Комбінуючи різні рестриктази і лігази, можна розрізувати нитку ДНК у різних місцях і одержувати рекомбінантні молеку­ли (наприклад, плазмідну ДНК із вмонтованим чужим геном).

Вмонтовування в геном реципієнта. Векторні молекули, які містять у собі фрагменти чужорідної ДНК, повинні мати власти­вість, яка забезпечує третій етап генної інженерії — проникнення в клітину реципієнта і вмонтовування в її геном. Реципієнтні клі­тини, тобто клітини, обрані для клонування гена, можуть бути як про-, так і еукаріотичними. Найчастіше для цього використову­ють бактерії, оскільки їх легко одержувати у великих кількостях. Перенесення генів може здійснюватися з однієї бактерії в іншу за допомогою плазмід.

Рекомбінативні молекули ДНК відокремлюють від молекул, що містять тільки донорську або тільки плазмідну ДНК. Для їх­нього поділу використовується плазміда, що має два гени стійкос­ті до двох визначених антибіотиків. При цьому клітини, що рос­туть за наявності двох антибіотиків, містять тільки вихідну плаз-міду. Клітини, що гинуть під дією двох антибіотиків, позбавлені плазмід і містять тільки донорську ДНК. Клітини, що ростуть за наявності одного антибіотика і гинуть за наявності іншого, міс­тять рекомбінантну плазміду.

Якщо в плазміду вмонтовані інші гени, вони передаються в клітину-хазяїна шляхом трансдукції і вмонтовуються в її геном, де здатні до швидкої реплікації за допомогою ферментативної сис­теми клітини-хазяїна. Цей процес швидкого одержання великої кількості однакових копій називається клонуванням. Клон — це велика популяція ідентичних молекул, бактерій, клітин, організ­мів, які отримані від одного предка.

Клонування генів — це процес, що включає виділення й амп­ліфікацію (дублювання великої кількості) окремих генів у реци-пієнтних про- й еукаріотичних клітинах. Ці клітини, які містять потрібний нам ген, можна використовувати для одержання: а) ве­ликої кількості білка, що кодується даним геном, або б) великої кількості самого гена у високоочищеному вигляді.

Крім плазмід як вектор використовують фаги (фаг лямбда), віруси (мавпячий вірус 8У40). Під час використання фагів і віру­сів генетичний матеріал переноситься за допомогою трансдукції. Особливим випадком трансдукції є перенесення чужорідних ге­нів в еукаріотичні клітини за допомогою неонкогенних вірусів і фагів. Уперше припущення, що трансдукція можлива в еукаріо-тів, висловив С.М. Гершензон у 1966 р. під час дослідів на шовко­вичному шовкопряді.

Рекомбінантна ДНК-технологія має як наукове значення (дає змогу виділити окремий ген складного організму і вивчити його функцію на молекулярному рівні), так і практичне застосування. За допомогою рекомбінантної ДНК-технології можна виробляти різні білки для медичної практики. Такі ліки безпечніші, ніж аналогічні білки, отримані безпосередньо з організмів. Першим таким рекомбінантним препаратом став інсулін.

Інший важливий напрям біотехнології — виробництво вак­цин. Такі вакцини не можуть спричинювати хвороб, тому що ви­готовляються з одного із поверхневих білків. Ген такого білка ви­користовується для біореконструкції бактерій. Так створена вак­цина проти гепатиту В. Успішно ведеться робота над вакцинами для гепатитів А, С, хламідіозів, герпесу й інших захворювань.

Трансі енні організми. За допомогою методів генної інженерії можна одержати різні організми, які мають у складі свого гено­му чужорідні гени інших організмів. Такі організми називаються трансгенними. Ця галузь науки швидко розвивається.

У різних галузях господарської діяльності людини використо­вуються трансгенні бактерії. Крім того, що бактерії використову­ються для клонування генів і виробництва білка, вони реконстру­юються і для інших цілей.

Так, біоінженерні бактерії використовуються для оздоровлен­ня рослин. Бактерії, що живуть у рослинах і стимулюють утворен­ня кришталиків льоду, були змінені з холод-плюс на холод-мінус рослини. Такі бактерії почали захищати вегетативні частини рос­лин від морозу. У бактерій, що утворюють симбіоз із коренями кукурудзи, були введені гени (від інших бактерій), які кодують токсин для шкідливих комах. У природі існують бактерії, що мо­жуть розчепити будь-яку органічну речовину. Бактерії відбира­ються за здатністю розщеплювати певну речовину, а згодом ця здатність посилюється внаслідок біотехнології. Таким шляхом були створені бактерії, які поїдають нафту, що розлилася внаслі­док техногенних катастроф.

Бактерії використовують для бактеріального синтезу. Так, були реконструйовані бактерії для виробництва амінокислоти фенілаланіну.

Широке використання рекомбінантних бактерій у сільському господарстві, промисловості, захисті навколишнього середовища обмежувалося побоюванням того, що такі бактерії можуть змі­нити природні мікроорганізми в екосистемах з виникненням не­сприятливих наслідків. На даний час розроблено методи визна­чення, вимірювання і навіть блокування діяльності цих клітин у навколишньому середовищі.

Зручним об'єктом для генетичних маніпуляцій виявилися рослини, тому що рослинні клітини можна вирощувати в культу­рі, де з кожної клітини отримують цілу рослину.

Ведуться роботи зі створення біоінженерних рослин, що мо­гли б мати такі властивості: 1) високу пристосованість до умов зовнішнього середовища; 2) містити більшу кількість необхідних для людини поживних речовин; 3) тривалий час зберігатися без псування.

Розробляються трансгенні рослини, здатні продукувати в ін­тересах людини хімічні речовини й ліки. Реконструйовано карто­плю для продукції альбуміну людини. Передбачається, що в май­бутньому ці рослини зможуть утворювати такі білки, як гормони людини.

Швидкими темпами розвивається біоінженерія тварин. Яй­цеклітину вміщують у спеціальну мішалку разом із чужорідною ДНК і дрібними силікон-карбідними голками. Голки роблять множинні отвори в оболонці, крізь які ДНК попадає в клітину. За допомогою цієї технології бичачий гормон росту був уведений у яйцеклітини багатьох видів тварин. Завдяки цій технології отримали великих риб, корів, свиней, кроликів, овець. Транс­генні тварини створені для виробництва продуктів медичного значення.

Ланцюговим інструментом для генетичних досліджень стали трансгенні миші. Вони дають важливу інформацію для плануван­ня генної терапії в людини. Вчені, що вивчають м'язову дистро­фію Дюшена, виділили ген і його продукт — нормальний білок дистрофін, що відсутній у хворих. Запропоновано спосіб забезпе­чення хворих дітей дистрофіном. Але що буде, якщо дистрофін потрапить в інші тканини або його буде утворюватися занадто ба­гато? Для вирішення цих питань були створені трансгенні миші, у м'язах яких міститься дистрофіну в 50 разів більше, а також продукується цей білок в інших тканинах. Дистрофін не викли­кає в таких мишей патологічних відхилень.

Трансгенні миші виявилися вкрай необхідними при вивченні моногенних хвороб, злоякісних пухлин і навіть мультифакторі-альних хвороб людини.

Проте трансгенна технологія є неточною, тому що введення ДНК не спрямоване у визначений локус хромосоми. Ген, що пере­носиться, може порушити функцію іншого гена або потрапити під контроль інших генів. Навіть якщо трансген вставляється в хро­мосому й експресується, його ефект може бути перекритий таким самим геном клітини-хазяїна. Тому була розроблена технологія більш точного "націлювання" гена, при якій ген, що вводиться, займає місце свого двійника у хромосомі клітини-хазяїна. При цьому використовується природний процес гомологічної реком­бінації. Унаслідок такої технології заміняють інактивованим ге­ном активний ген у мишей і простежують ефект його відсутності навіть в ембріона. Так вивчають функцію білків імунної системи, механізм взаємодії онкогенів у виникненні пухлини, розвиток ге­нетичних захворювань.

"Націлювання" гена — складна методологія, вона не працює у заплідненій яйцеклітині ссавців. Ген можна впровадити тільки в клітину на ранніх етапах розвитку зародка, до його імплантації в стінку матки. Клітини такого зародка тотипотентні і багато генів у них ще не експресовані.

"Націлювання" гена має велике значення при створенні моде­лей генетичної патології у тварин. Важливо те, що вчені іденти­фікують версію людського алеля, який спричинює хворобу в тва­рин. Потім відповідний людський мутантний алель переносять в ембріональні стовбурові клітини і, нарешті, схрещують тварин, гомозиготних за інактивованим геном.

Тварин з "виключеним" геном використовують для вивчення хвороб, в яких задіяно багато генів. Наприклад, вивчають ате­росклероз шляхом інактивації сполучення генів, продукти яких контролюють ліпідний метаболізм.