Регуляция экспрессии генов у прокариот

А)Регуляция содержания РНК в процессе биосинтеза

Образование РНК у прокариот чаще всего регу­лируется на уровне инициации транскрипции не­сколькими способами. Первый заключается в модификации структуры РНК-полимеразы. Так, бета-(или бета-прим) субъед. РНК-полимеразы Е. coli изменяется при заражении клеток некоторыми бактериофагами. Другой пример- образование но­вой, сигма-субъед. при споруляции определен­ных штаммов Bacillus. И в том и другом случае изменяются способность РНК-полимеразы к свя­зыванию с промотором и скорость транскрипции соотв-щих генов. Второй способ - изменение пространственной струк­туры ДНК, что влияет на способность РНК-полимераз связываться с определенными промотора­ми и инициировать синтез РНК. И наконец, взаимо­действие РНК-полимеразы с некоторыми промото­рами может ингибироваться или стимулироваться белками, которые связываются с ДНК в месте присоединения полимеразы или вблизи него. На связывание таких регуляторных белков - репрессоров и активаторов- часто влияют определенные метабо­литы, играющие роль корепрессоров и коактиваторов.

Скорость элонгации РНК зависит также от вто­ричной структуры мРНК. Сигналы, которые опре­деляют, дойдет ли транскрипция до конца или закончится преждевременно, играют ключ.роль в рег-ции уровня мРНК. В подобных слу­чаях за прекращ-е или продолж-е транскрип­ции отвечают определ.нуклеотидные после­дов-ти и белки.

В)Согласованная регуляция экспрессии генов

Согласованная регуляция групп родственных ге­нов. У Е. coli гены, кодирующие белки одного и того же метаболического пути или определяющие близ­кородственные функции, часто рег-ся согла­с-но. Это значит, что их экспрессия нач-ся и заканч-ся или согласованно продолжается в ответ на один и тот же регуляторный сигнал. Гены, подчиняющиеся согласованной регуляции, в геноме часто бывают сцеплены и транскриби­руются с промотора, находящегося на 5'-конце та­кой группы генов (кластера), в виде единственной молекулы РНК, называемой полицистронным(или полигенным) транскриптом. Группа координиро­ванно экспрессирующихся генов называется опероном.Три гена, кодирующие ферменты, ответствен­ные за метаболизм галактозы у Е. coli, организо­ваны в оперон с промотором (Р) и примыкающим к нему регуляторным сегментом-оператором (О) на 5'-конце транскрибируемой последовательности: galE-galT-galK. Ген galR, кодирующий репрессор gal-оперона, не сцеплен с опероном.

Гены, кодирующие несколько родственных функ­ций, не всегда образуют единый оперон. Так, гены, кодирующие 30S- и 50S-рибосомные белки, орга­низованы во множественные опероны, в чей состав иногда входят гены, кодирующие другие белки, которые участвуют в транскрипции и/или трансля­ции

Позитивная и негативная регуляция. Негативная регуляция инициации транскрипции, или репрессия, осуществляется белками-репрессорами, которые связываются с операторами. Поскольку последо­вательности оператора и промотора часто перекры­ваются, связывание репрессоров со своими опера­торами ограничивает доступ РНК-полимеразы к промотору, подавляя тем самым инициацию транскрипции. Позитивная регуляция может осущ-ся путем связывания специфических бел­ков с нуклеотидными последовательностями, расположенными в области промотора. Считается, что связанный активаторный белок способствует ассоциации РНК-полимеразы с промотором и, сле­довательно, увеличивает вероятность инициации транскрипции.

Гены, кодирующие регуляторные белки, которые связываются с операторными или активаторными последовательностями, могут находиться как вбли­зи контролируемых ими генов, так и далеко от них. Например, ген, кодирующий репрессор галактозного оперона (galR), не сцеплен с транскрипционной единицей, состоящей из генов galE, galT и gal К. Напротив, позитивная или негативная регуляция транскрипции арабинозного оперона за­висит от того, образуется или нет комплекс между арабинозой и белком, кодируемым только сцеп­ленным с опероном геном ara C.

В) Регуляция экспрессии лактозного оперона

Негативная регуляция. Бактерии Е. coli могут использовать в кач-ве единств.источника углерода и энергии лактозу, поскольку они способ­ны образовывать в большом количестве b-галактозидазу - фермент, расщепляющий лактозу на глюко­зу и галактозу. Однако при росте на других источниках углерода в клетках Е. coli образуется очень мало b-галактозидазы. Ген, ответственный за синтез b-галактозидазы (lacZ), называется индуцибельным, поскольку кодируемый им фермент синтезируется только тогда, когда в клетке присутствуют сахара, имеющие b-галактозильные остатки. Помимо b-галактозидазы, b-галактозиды индуцируют образова­ние еще двух белков: b-галактозидпермеазы (коди­руемой геном lacY), необходимой для проникнове­ния b-галактозидов в клетку, и b-галактозидтрансацетилазы (1ас А), фермента с невыясненной пока функцией. В этих трех генах- lacZ, lacY и lacА - содержится вся информация о белках, коди­руемых lac-опероном. Они транскрибируются в еди­ную полицистронную РНК, при трансляции кото­рой образуются почти одинаковые количества соот­ветствующих белков.

Со структурными генами lac-оперона связаны несколько типов регуляторных элементов,. Промотор-это нуклеотидная последовательность, с которой свя­зывается РНК-полимераза и начинается транскрип­ция трех структурных генов.Оператор-это сайт, с которым связывается lac-репрессор, подавляющий транскрипцию lac-оперона. Ген lac I, не входящий в состав lac-оперона, кодирует репрессор-полипептидную цепь с мол. массой 37000 Да. Репрессор прочно связывается с оператором, находясь в тетрамерной форме.

Поскольку промоторная и операторная после­довательности перекрываются, связывание репрессора с оператором мешает связыванию РНК-полимеразы с промотором, что приводит к блокир-ю транскрипции структурных генов. Транс­крипцию оперона можно индуцировать, если бло­кировать связывание репрессора с оператором. Такое блокирование происходит при свя­зывании одного из b-галактозидов с той или иной субъединицей репрессора, что уменьшает сродство последнего к оператору. После отсоединения реп­рессора от промотора полимераза может связаться с промотором и инициировать транскрипцию опе­рона.

Очень важно сохранение нуклеотидной после­довательности домена lac-оператора, связывающего репрессор. Мутации, уменьшающие сродство репрессора к оператору, приводили к конститутивномусинтезу ферментов, кодируемых lac-опероном, т. е. к экспрессии lac-ферментов в отсутствие индуктора. Мутации, сопро­вождающиеся накоплением репрессора в клетках или увеличением сродства репрессора к оператору, делали lac-оперон неиндуцибельным.

Позитивная регуляция. Для экспрессии lac-оперона, как и других индуцибельных оперонов, , необходимо не только снять репрессию оперона, но и получить некий сигнал. Таким сигналом служит комплекс циклического AMP(cAMP) с белком-активатором катаболизма (САР-catabolite activator protein), который связывается со специфической послед-тью, находящейся в самом начале lac-промотора. сАМР, образуется из АТР в ответ на самые разные вне-и внутрикл.события. САР представляет со­бой димер из идентичных полипептидных цепей с мол. массой 22 кДа. Связывание комплекса САР-сАМР со специфической последовательностью в начале промотора приводит к усилению транс­крипции lac-оперона почти в 50 раз. Сам по себе САР не способен к такому связыванию и стимуля­ции транскрипции. Усиление транскрипции с помощью комплекса САР-сАМР можно объяснить тем, что, связываясь с ДНК в непосредственной близости от сайта присоединения РНК-полимеразы, он усилива­ет сродство этого фермента к промотору. Альтернативная гипотеза заключается в том, что связывание САР-сАМР cСАР-сайтом предотвра­щает присоединение РНК-полимеразы к располо­женному поблизости слабому промотору и увели­чивает тем самым вероятность того, что полимераза свяжется с «правильным» промоторным сайтом.

Г). Временная регуляция генной экспрессии в жизненном цикле бактериофага l.

У бактериофага l есть два альтернативных способа существования. При литическом пути все вирусн.гены экспрессируются в определ.вре­менной послед-ти, в рез-те чего обра­з.примерно сотня фаговых частиц и происхо­дит лизис инфицированной бактерии. Интегрированная форма вирусн.генома называется профагом.В лизогенных клетках профаговая ДНК многократно реплицируется при помощи клеточн.ап-та так, как будто она является частью клеточного генома. При этом, од­нако, все фаговые гены, кроме одного, выключены.

Литический путь. Гены, кодирующие структурные белки (головки и хвосты), сконцентри­рованы в одной области ДНК; гены, кодирующие ферментативные (репликацию и рекомбинацию) и регуляторные (репрессию и антитерминацию) функции, сосредоточены в другой области генома.

После инфекции фаговая ДНК замыкается в кольцо путем соединения липких концов. Затем РНК-полимераза Е. coli транс­крибирует те фаговые мРНК, которые кодируют белки, необходимые на самых ранних этапах жиз­ненного цикла,- т.н.предранние мРНК. Одна из этих предранних мРНК транс­крибируется справа налево с промотора P_L, а тер­минатором служит последовательность t_L1. На этой мРНК (L1) синтезируется регуляторный белок N, работающий как антитерминатор. Другая предранняя мРНК транскрибируется слева направо с промотора P_R к терминатору t_R1и кодирует только белок Сrо.

По мере накопления белка N происходит аттенуация(ослабление;регуляция транскрипции с помощью сигнала терминации транскрипции, расположенного между промотором и началом первого структурного гена)терминации в t_L1и t_R1, РНК-полимераза продолжает транскрипцию через эти сайты с обра­зованием мРНК второго типа - задержанных ранних транскриптов. Более крупный транскрипт, начи­нающийся с промотора P_L(L2), коди­рует ферменты, участвующие в рекомбинации, и ферменты, катализирующие встраивание ДНК фага l в ДНК клетки-хозяина. Задержанный ранний транскрипт, начинающийся с промотора P_R(R2), кодирует фер­менты, ответственные за репликацию фаговой ДНК (белки О и Р), и еще один регуляторный белок Q. Белок Q вызывает аттенуацию терминации транс­крипции в терминаторном сайте (t_R3), расположен­ном сразу за промотором P_R'. При транскрипции с промотора P_R' транскрибируются гены (S и R), ответственные за включение лизиса клеток. К.т., поскольку ДНК фага l, сразу после инфекции замыкается в кольцо, S- иR-гены оказы­ваются рядом с генами, кодирующими белки голов­ки и хвоста фага. След-но, в рез-те транскрипции, инициир-ной в P_R и продолжен­ной через t_R3, образуется мРНК, кодирующая белки лизиса и все структурные вирусные белки. Итак, мы рассмотрели образование аппарата, необходимого для литич.инфекции: ферментов репликации вирусной ДНК и вирусных белков, участвующих в формировании зрелых фаговых частиц.

Лизогенный путь. Для того чтобы понять это, нужно усложнить схему строения про­моторов Р_L, и P_R и ввести несколько дополни­тельных генов, генных продуктов и промоторов. На самом деле P_L и P_R являются частью сложной регуляторной области, в которой промоторы пе­ремежаются с операторными послед-тями O_L и O_R соответственно. O_L и О_R -это сайты связывания двух регулягорных белков: репрессора сI и антирепрессора Сrо. Белок Cro-это продукт трансляции предранней мРНК, транскрибируемой вправо с промотора P_R. Репрессор кодируется геном сI, локали­зованным между P_R и P_L /O_L. сI-мРНК транскрибируется в направлении влево от промо­тора P_RE, находящегося справа от Cro-гена. P_RE сам активируется двумя «позитивными» регуляторными белками, cII и cIII, которые синтезируются после того, как благодаря действию белка N образуются транскрипты мРНК, инициированные в P_R и P_L, соответственно.

По мере накопления репрессора сI происходит его связывание с левым и правым операторными сайтами, в результате чего подавляется экспрессия всех генов, транскрибирующихся с P_R и Р_L. В этом случае предпочтительным оказывается лизогенный путь, поскольку блокируется образование фермен­тов репликации и структурных вирусных белков, а небольшое количество интеграционного фермента Int, синтезированного с задержанной ранней мРНК, успевает катализировать рекомбинацию между фа­говой и бактериальной ДНК до момента полной репрессии фаговых генов.

Д)Трансляционная регуляция экспрессии некоторых генных продуктов

Синтез белков, составляющих собственно ап­парат трансляции, регулируется на уровне трансля­ции. Гены, кодирующие белки больших (L) и малых (S) субчастиц рибосомы и некоторых белков, участ­вующих в процессе трансляции (в том числе EF-Tu и EF-G), рассеяны по нескольким оперонам. Это позволяет координированно регу­лировать синтез тех генных продуктов, которые должны функционировать согласованно. Экспрессия таких генов как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции происходит координированно. Как мы увидим далее, синтез рибосомных белков частично регулируется также путем изменения со­держания трех рРНК и кинетических параметров процесса сборки рибосом.

Контроль трансляции некоторых оперонов ри­босомных белков осуществляется по одинаковому механизму. Один из рибосомных белков, кодируемый полицистронной мРНК, связывается со специфической последовательностью, локализованной либо на 5'-конце мРНК, либо в начале одной из кодирующих последовательностей в середине мРНК. В обоих случаях это блокирует доступ ри­босом к ближайшей инициаторной трансляционной последовательности. В зависимости от места нахож­дения сайта инициации трансляции мРНК-вблизи 5'-конца кодирующей последовательности или в од­ном из внутренних участков-блокируется трансля­ция всей мРНК или ее части. Контроль по типу обратной связи, при котором продукт регулирует экспрессию собственного гена, называется аутоген­ной регуляцией.Регуляция может осуществляться на уровне транскрипции (например, репрессорный бе­лок сI фага l, регулирует транскрипцию соответст­вующего гена с P_RM ) ина уровне трансляции, как в приведенном примере.

При сборке рибосом некоторые из рибосомных белков связываются с рРНК. При наличии достаточного количества рРНК вновь синтезированные рибосомные белки ассоциируют с ней, чтобы инициировать сборку рибосом. При недостатке же рРНК накапливающиеся рибосомные белки связываются с собственной мРНК вместо рРНК и соответственно блокируют собственный синтез и синтез других родственных рибосомных белков. В рез-те предотвращается накопление свободных рибосомных белков. Т.о., некоторые ключевые рибосомные белки-это репрессоры, блокирующие трансляцию кодирую­щей их мРНК. Одновременно они блокируют синтез и других белков, кодируемых той же мРНК. Спо­собность рибосомных белков узнавать как рРНК, так и свою собственную мРНК связана с тем, что обе эти РНК обладают сходными нуклеотидными последовательностями . Так, последова­тельности, в которых рибосомные белки S8 и S7 связываются с 16S-PHK и своими собственными м РНК, имеют сходную вторичную структуру, причем петли имеют идентичные послед-ти.

Вопрос №74

Альтернативный сплайсинг– процесс, позволяющий индивидуальным генам продуцировать множество различных активных белковых изоформ.

Примеры альтернативного сплайсинга:

1) Кальцитонин и белок CGRP - различные пептиды, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга одного гена. Кальцитонин образуется в клетках щитовидной железы и является пептидным гормоном, регулирующим уровень кальция в крови. Белок CGRP – синтезируется в нейронах и является сосудорасширяющим белком, участвующем в формировании вкусовых ощущений.

2) Один из ядерных генов риса продуцирует два совершенно неродственных белка – один является митохондриальным рибосомным белком S14, второй – В-субъединицей митохондриальной сукцинатдегидрогеназы.

Вопрос №75

РНК-интерференция (RNA silensing) – это подавление экспрессии генов у эукариот (замалчивание генов) на посттранскрипционном уровне, индуцированное короткими интерферирующими РНК (small interfering RNA, siРНК).

Появление в клетке dsРНК вызывает каскад событий, известный как РНК-интерференция.

1. Фермент Дайсер связывается с dsРНК и разрезает ей на короткие фрагменты в 21-23 п.н. – siРНК (short interfering RNA).

2. siРНК связываются с ферментативным комплексом RISC (RNA-induced silencing complex), который использует одну её нить (комплементарную мРНК) для связывания с мРНК.

3. Нуклеазная активность комплекса RISC деградирует мРНК.

Основные свойства РНК-интерференции:

• Специфичность (подавляется экспрессия только того гена, нуклеотидная последовательность которого полностью соответствует нуклеотидной последовательности вводимой dsРНК).

• РНК-интерференция реализуется на посттранскрипционном уровне (фрагменты dsРНК, соответствующие последовательностям промотора или интрона не вызывали РНК-интерференцию).

• Эффект РНК-интерференции, возникший в каком-либо участке тела С. elegans может распространяться по всему организму и передаваться по наследству потомкам.

76. Генетическая инженерия – использование методов молекулярной генетики и молекулярной биологии для конструирования in vitro рекомбинантных ДНК (или организмов) с заданными наследственными свойствами.