Вопрос 64. Возбудитель чумы

1. Морфология возбудителя чумы

2. Устойчивость возбудителя чумы

3. Биология, культуральные свойства

1.Чума относится к особо опасным инфекциям и является типич­ным зоонозом с природной очаговостью. Грызуны (суслики, сурки, мыши, крысы) являются резервуаром инфекции в при­роде и передают ее один другому главным образом через блох. От больных грызунов (также через блох) может заразиться че­ловек, что ведет в дальнейшем к вспышкам чумы среди людей.

Морфология: возбудитель — Yersinia pestis, относится к роду иерсиниа, семейству энтеробактерий. Представляет собой непод­вижную, закругленную на конце овоидную палочку размерами 1,5-2 х 0,5-0,7 мкм. Описан полиморфизм возбудителей чумы с появлением удлиненных зернистых, нитевидных и фильт­рующихся форм.

Возбудитель чумы не образует спор, имеет капсулу, грамотрицателен, легко окрашивается анилиновыми красителями (более интенсивно на концах — биполярное окрашивание). В мазках из бульона бактерии чумы располагаются цепочками различ­ной длины обычно с хорошо выраженной биполярностью. На агаре с 3% поваренной соли можно обнаружить причудливые формы.

Микроб чумы при культивировании на искусственных пита­тельных средах в условиях повышенной температуры (37 °С) образует капсулы. Капсула лучше образуется на влажных и слегка кислых питательных средах. Жгутики отсутствуют.

2. Устойчивость возбудителя чумы вне организма к воздействию факторов среды неравнозначна. Понижение температуры увели­чивает сроки выживания бактерий, на пищевых продуктах и предметах обихода они сохраняются до 3 мес, в гное бубонов — 40 дней, в крови и мокроте — 1 мес и более. При температуре 55 °С они погибают через 10—15 мин, при 100 °С — спустя не­сколько секунд. Обычные дезинфекционные средства в рабо­чих концентрациях (сулема 1 : 1000, 3—5%-ный раствор лизола, 3%-ный раствор карболовой кислоты, 10%-ный раствор из­весткового молока), антибиотики (стрептомицин, тетрациклин, левомицетин) оказывают губительное действие на палочку чу­мы. Бактерии чумы образуют эндо- и экзотоксин, содержат до 20 антигенов.

3. Культуральные свойства: возбудитель чумы — факультативный анаэроб. Хорошо растет на обычных жидких и питательных средах (мясо-пептонный агар, бульон) при температуре 25— 30 "С. Для стимуляции роста микроба чумы целесообразно прибавлять в питательную среду сульфит натрия, гемолизиро-ванную кровь, которые синтезируют дыхательные ферменты. На агаровых пластинах рост микроба чумы уже через 24 ч за­метен в виде нежного сероватого налета.

Колонии на агаре соответствуют R-форме (вирулентные); нача­ло развития колонии обнаруживается в виде появления очень маленьких рыхлых глыбок и затем плоских слоистых образова­ний с неровными краями, напоминающих кружевной платочек серовато-белого с голубоватым оттенком цвета. Колониям присущ полиморфизм.

На бульоне культура растет в виде хлопьев, взвешенных, в со­вершенно прозрачной жидкости с рыхлым осадком на дне. Возбудители чумы восстанавливают нитриты в нитраты, фер­ментируют с образованием пленки глюкозу, левулезу, мальтозу, галактозу, арабинозу, ксилозу и маннит, продуцируют дегидра-зы и уреазы. Желатин не разжижают, индол и сероводород не образуют.

Вопрос 65.Лабораторная диагностика чумы

1. Забор материала и микроскопическое исследование

2. Бактериологическое исследование

3. Биологическая проба

4. Ускоренные методы бактериологического исследования

5. Лабораторная диагностика чумы

1. Чума является чрезвычайно контагиозной, поэтому взятие ма­териала от больного (особенно легочной формы) производится с соблюдением мер предосторожности. Работа в очаге проводит­ся в полном противочумном костюме.

В лабораторию могут быть доставлены следующие материалы:

• содержимое бубона (легочная форма чумы);

• отделяемые язвы или пунктет из карбункула (кожная форма чумы);

• материал из зева, взятый тампоном, и мокрота (легочная фор­ма чумы);

• секционный материал (кусочки органов трупа, кровь);

• живые грызуны;

• трупы грызунов;

• блохи грызунов;

• вода;

• пищевые продукты.

Материал необходимо брать до назначения лечения. Значение микробиологического диагноза огромно, особенно для выявле­ния первых случаев чумы. Предварительный диагноз устанавли­вают на основании микроскопического исследования материала, окончательный — на основании выделения и идентификации культуры.

Микроскопическое исследование: мазки фиксируют погружением полностью в жидкость Инпифорова на 20 мин. Окраска по Граму обязательна во всех случаях. Одновременно окрашивают мазок метиленовым синим Леффлера, так как этот метод луч­ше выявляет биполярность.

Бактериологическое исследование: посевы исследуемого мате­риала производят на агар добавлением стимуляторов роста (кровь, сульфит натрия). При исследовании материала, обиль­но загрязненного посторонней микрофлорой (загнившие тру­пы, мокрота), к агару добавляют генциановый фиолетовый 1 : 100 000. В случаях подозрения на наличие бактериофага по­севы обрабатывают антифаговой сывороткой. Инкубацию по­севов проводят при 28 °С. В положительных случаях через 12 ч появляются колонии в виде характерных "кружевных платочков". Когда чистая культура выделена путем прямого посева, она подлежит идентификации на основании следующих данных.

• внешний вид колонии на агаре;

• характерный рост на бульоне;

• типичная морфология микробов в мазках и отрицательная ок­раска по Граму;

• типичная патологоанатомическая у лабораторных животных при заражении их чистой культурой;

• агглютинация со специфической сывороткой;

• отношение к специфическому бактериофагу. Исследование ферментативных свойств, подвижности и т. п. производят лишь в специальных случаях для дифференциаль­ного диагноза с родственными видами бактерий. Проба с фагом осуществляется на твердых средах путем нанесения капли фага на свежий посев культуры и на жидких — путем добавления в бульонную культуру фага в количестве 1/10 объема культуры. Окончательное заключение делают на основании изучения комплекса признаков исследуемой культуры. При этом не сле­дует забывать о явлении изменчивости.

3. Биологическая проба обязательна при исследовании; наиболее чувствительными из лабораторных животных являются мор­ские свинки и белые мыши. Для постановки биологической пробы животных заражают внутрибрюшинно, подкожно или внутрикожно, а в случае загрязнения материала посторонней микрофлорой — втиранием в скарифицированную кожу.

В зависимости от способа заражения и степени чувствительно­сти к возбудителю животные погибают от чумы на 3—9-й день после инфицирования, изменения во внутренних органах в ви­де геморрагического воспаления, кровоизлияния: вмазках-отпечатках из органов — множество чумных микроорганизмов; посевы инфицированных органов и крови дают обильный рост возбудителя.

4. Ускоренные методы бактериологического исследования. Метод ускоренного обнаружения возбудителя чумы с помощью бакте­риофага, внесенного в исследуемый материал, используют для исследования объектов, имеющих основное практическое значение: материал от больного, от трупа, из внешней среды. Исследуемый материал наносят на 3 агаровые пластины сгемо-лизированной кровью и генциановым фиолетовым. На первой и второй агаровой пластине висследуемый материал сразу же вносят чумной бактериофаг (разведенный в 10 раз). На третью чашку бактериофаг не добавляют (контроль). Результаты начинают читать через 2,5—3 ч после помещения их в термостат. При наличии значительного количества мик­робов чумы в исследуемом материале уже через 2 ч на фоне начального роста чумного микроба видны мелкие палочки бак­териофага. Метод ускоренной диагностики чумы основан на свойстве чумного бактериофага быстро (30—40 мин) размно­жаться в присутствии микроба чумы.

Большого внимания заслуживает люминесцентно-серологический метод, с помощью которого можно обнаружить возбудитель чумы в воздухе, воде, пищевых продуктах. Реакция нарастания титра фага (в качестве индикаторного фага предложен чумной бактериофаг, выпускаемый институтом "Микроб" вкачестве эталонной культуры). Применение реакции нарастания титра фага для индикации чумных микробов основано на экспери­ментальном исследовании; пользуясь реакцией нарастания титра фага, за 3—3 Уг ч удается обнаружить 1 млн палочек чумы.

В качестве исследуемого материала могут быть использованы вода, кровь, отпечатки из органов, выделения из бубона. Ма­териал сначала подращивают на средах, затем прибавляют ген­циан фиолетовый (1 мл 0,1%-ный водно-спиртовой раствор на 100 мл среды) для подавления посторонней микрофлоры, а за­тем добавляют в пробирки разные концентрации фага.

5. Серологические реакции в практике нашли широкое применение. Они используются при подозрительных на чуму заболеваниях для ретроспективного диагноза, при обследованиях природных источников чумы. С этой целью применяют иммунофермент-ную агглютинацию, реакцию пассивной гемагглютинации, ре­акции непрямой агглютинации. Экспресс-методом является люминесцентно-серологический, позволяющий обнаружить возбудителя в исследуемом материале через 2 ч.

Вопрос 66.Возбудитель туляремии

1. Морфологические и культуральные свойства возбудителя туляремии

2. Устойчивость к физическим и химическим факторам

3. Антигенное строение

4. Патогенность возбудителя туляремии

1. Для туляремии (Francisella tularensis) как одной из природно-очаговых зоонозных инфекций характерна триада биоиеноза:

• возбудитель;

• резервуары возбудителя;

• переносчики — кровососущие насекомые. Выделяют 3 подвидатуляремийного микроба:

• неарктический (американский);

• среднеазиатский;

• голарктический (европейско-азиатский).

Неарктический подвид бактерии, в отличие от остальных, ха­рактеризуется высокой патогенностью для человека и лабора­торных животных.

Морфология: туляремийные бактерии имеют очень мелкие раз­меры — 0,3—0,5 мкм, способные проходить через некоторые бактериальные фильтры. При культивировании на искусствен­ных питательных средах микроб туляремии обычно имеет фор-. мы очень мелкого кокка, а в органах животных чаще встреча­ется в виде коккобактерий.

В культурах на питательных средах бактерии туляремии обна­руживают полиморфизм, особенно выраженный у американ­ской разновидности. Микроб неподвижен, спор не образует, имеет небольшую капсулу. В культурах характерно образова­ние бактериями слизи, легко обнаруживаемой при изготовлении мазков на стекле. Бактерии туляремии окрашиваются все­ми красками, обычно применяемыми в лабораторной практи­ке, но заметно бледнее, чем многие бактерии. По Граму туляремийные бактерии окрашиваются отрицательно. Мазки-отпечатки из органов окрашиваются по Романовскому-Гимзе, при этом туляремийные микробы отличаются от другой (посторонней) флоры более нежной фиолетовой окраской и более мелкими размерами.

Биология, культуральные свойства: микроб туляремии прихот­лив в отношении выращивания на искусственных питательных средах. Он не растет на обычном мясо-пептонном агаре или бульоне. Микробы удается культивировать на желтковых сре­дах при добавлении цистина и других питательных веществ, особенно крови. Температурный оптимум 36—37°С. Строгие аэробы. Изолированные колонии удобно получать при посеве на чашки со средой Емельяновой (гидролизат рыбной муки, же­латин, дрожжи, хлористый натрий, глюкоза, цистин, агар) или средой Френсиса — (мясо-пептонный агар с 1%-ным пептоном, 0,5%-ный хлористый натрий, цистин, глюкоза).

После стерилизации эти среды добавляют к 5—10 мл кроличьей дефибринированной крови. Колонии на этих средах — белова­того цвета с голубоватым оттенком, круглые, с ровным краем, выпуклые, гладкие, блестящие, при разреженном посеве они достигают (через несколько дней) 1—2 мм и более в диаметре.

В жидких питательных средах туляремийный микроб размно­жается хуже, причем рост отмечается лишь на поверхности среды, что связано с аэрофильностью бактерии. Хорошие ре­зультаты выращивания можно получить либо при добавлении к жидким средам коллоидов (куриного желтка, агара и т. д.), либо при аэрации среды. Способность сбраживать углеводы и спирты у микроба туляремии ограниченна. Туляремийные микробы ферментируют до кислоты глюкозу, мальтозу, а в ря­де случаев — левулезу и маннозу. Лактозу, сахарозу, маннит и ряд других веществ туляремийные бактерии не ферментируют.

2. Устойчивость кфизическим и химическим факторам:во внеш­ней среде возбудитель сохраняется длительное время, особенно при низких температурах: в зерне и соломе при температуре ниже 0 °С до 6 мес, в замерших трупах животных — до 8 мес. В естественных условиях обнаруживали возбудители туляремии в воде ручьев, колодцев, а также в соломе и других объектах, это имеет важное эпидемиологическое значение. Туляремийные бактерии нестойки к высоким температурам — кипячение не­медленно убивает микробов, а нагревание до 60 °С обусловли­вает их гибель в течение 20 мин. Под действием прямых сол­нечных лучей туляремийные бактерии погибают через 20-30 мин, на рассеянном свету жизнеспособность их сохраняется до 3 дней.

Микроб туляремии нестоек к обычным дезинфицирующим веще­ствам - лизолу, фенолу, хлору, сулеме. Особенно чувстви­тельны бактерии к этиловому спирту и при его воздействии погибают менее чем за минуту.

3. Антигенное строение: туляремийный микроб содержит 2 анти­генных комплекса:

• оболочечный (Vi);

• соматический (О).

С оболочечным антигеном связаны вирулентность и иммуно-генные свойства возбудителя. При Vi-агглютинации, характер­ной для вирулентных культур, на дно пробирки в осадок выпа­дает стойкий агглютинат, при встряхивании легко разбиваю­щийся на мелкие хлопья; при О-агглютинации, свойственной полностью авирулентным культурам, в осадок выпадает не­стойкий агглютинат, при встряхивании легко разбивающийся на мелкие хлопья или почти гомогенную взвесь. Туляремийные бактерии обнаруживают антигенную близость с бруцеллами: специфическая туляремийная агглютинирующаяся сыворотка высокого титра может в небольших разведениях агг­лютинировать бруцелл, а бруцеллезная сыворотка - туляре­мийные бактерии. Некоторые сапрофитные бактерии также обладают способностью частично агглютинироваться туляре-мийной сывороткой. У музейных штаммов туляремийных бак­терий может наблюдаться бактериофагия, но этот феномен можно обнаружить лишь при посеве на чашки со специально подобранными средами.

4. Патогенность. Штаммы туляремийных бактерий, выделяемые в природных очагах от грызунов, клещей и других объектов, а также от больных людей, обладают в высокой степени сходны­ми признаками, включая вирулентность. Различия обнаружива­ются лишь между штаммами - американским и европейскоазиатским. При культивировании на искусственных питатель­ных средах происходит превращения туляремийных бактерий из вирулентной S-формы в авирулентную R-форму, их обозна­чают как SR-вариант. Они обладают остаточной вирулентно­стью для чувствительных к туляремии животных, например белых мышей.

Болезнетворные свойства туляремийного микроба в основном связаны с токсическими веществами, представляющими собой эндотоксин. Микроб туляремии патогенен для многих видов млекопитающих, и особенно грызунов, но степень его пато-генности не для всех видов одинакова.

Наибольшую восприимчивость и чувствительность к туляре­мии проявляют полевки, водяные крысы, зайцы, хомяки, до­мовые мыши и другие грызуны и насекомые. У этих животных даже при минимальных дозах заражения заболевание протекает по типу острой септицемии, они выделяют возбудителя в большом количестве с мочой и калом и погибают с необычай­но интенсивным обсеменением бактериями внутренних орга­нов и крови.

Вопрос 67.Лабораторная диагностика туляремии людей