Многоточечное ковалентное присоединение фермента к поверхности носителя

Другой путь ужестчения структуры фермента заключается в его иммобилизации на носителе с образованием большого числа ковалентных связей. Для реализации многоточечного взаимодействия необходимо, чтобы размеры ферментной глобулы и поры носителя соответствовали друг другу. Если проводить иммобилизацию белка на произвольно взятом носителе, то такое соответствие можно получить лишь случайно, поскольку поверхность носителя и поверхность белка имеют свои индивидуальные рельефы, в общем случае не комплементарные друг другу.

Этого недостатка лишен сополимеризационный метод иммобилизации, позволяющий создать полимерный носитель, комплементарный молекуле фермента. Фермент химически модифицируют (например, по аминогруппам) аналогом мономера, т.е. соединением, содержащим ненасыщенные связи (например, хлорангидридом акриловой кислоты или акролеином). При последующей сополимеризации с мономером (например, с акриламидом или метакрилатом натрия) белковая глобула формирует вокруг себя поверхность носителя, комплементарную собственной, ковалентно к ней присоединяясь. Сополимеризационный метод дает уникальную возможность получать препараты ферментов, пришитых различным числом ковалентных связей к поверхности носителя, за счет варьирования степени модификации на стадии обработки фермента аналогом мономера.

Ферменты, иммобилизованные по сополимеризационной методике, обладают гораздо более высокой устойчивостью против инактивации при повышенных температурах, чем соответствующие нативные ферменты. Эффект стабилизации, определяемый как отношение констант скоростей необратимой инактивации нативного и иммобилизованного препаратов, возрастает с увеличением числа связей между ферментом и носителем и достигает больших величин. Например, для a-химотрипсина, пришитого к носителю 15 связями, стабилизационный эффект составляет более 1000 раз. Такие ферментные препараты сохраняют каталитическую активность при существенно более высоких температурах. Так, например, оптимум эстеразной активности трипсина, ковалентно вшитого в полиакриламидный гель 15 связями, наблюдается при температуре 75°С, что на 25° выше оптимума активности нативного фермента. Это указывает на резкое подавление быстрых обратимых денатурационных процессов в иммобилизованном препарате.

Следует отметить, что эффект стабилизации для иммобилизованного по сополимеризационной методике фермента зависит только от числа ковалентных связей с носителем, но не зависит ни от плотности гелевого носителя (т.е. от концентрации полимера в геле), ни от степени его набухания. Более того, проводя сополимеризационную иммобилизацию в отсутствие бифункционального сшивающего агента, удается получить водорастворимые ферментные препараты, также обладающие повышенной термостабильностью.