Внутримолекулярное сшивание фермента бифункциональными реагентами

Модификация фермента бифункциональными агентами в принципе может привести к наложению на белковую глобулу внутримолекулярных ковалентных сшивок. Следует ожидать, что сшивание увеличит конформационную жесткость белка и, следовательно, его стабильность. Этот подход (внутримолекулярное сшивание белка) активно используется в природе для увеличения стабильности белковых структур. K числу «природных сшивок» относятся как ковалентные 5-5-связи, так и нековалентные «солевые мостики», ионы Ca²⁺ и других металлов, связанные с молекулой белка, и т. п.

Успех или неудача при попытке повысить стабильность фермента обработкой бифункциональными реагентами в основном определяется соответствием длины реагента расстоянию между возможными центрами пришивки на белковой глобуле. Очевидно, что для каждого конкретного белка существует оптимальный размер сшивающих агентов. Единственно надежный путь определения размера подходящего реагента - эмпирический поиск.

Для этого изучаемый фермент модифицируют соединениями гомологического ряда бифункциональных реагентов, например алифатических диаминов или имидоэфиров алифатических дикарбоновых кислот, в условиях, когда не происходит межмолекулярного сшивания белковых молекул. Далее изучают зависимость стабилизационного эффекта от длины бифункционального реагента. Обычно такие зависимости имеют вид кривой с максимумом. Дело в том, что при модификации бифункциональным реагентом наряду с образованием «сшивок» происходит одноточечная модификация функциональных групп белка. Соотношение этих двух процессов тем сильнее сдвинуто в сторону реакции сшивания, чем больше на поверхности белковой глобулы пар функциональных групп, расстояние между которыми примерно равно длине сшивающего агента. Именно в этом случае наблюдаются максимальные стабилизационные эффекты.

Следует отметить, что эмпирический характер поиска оптимального сшивающего агента несколько снижает ценность метода внутримолекулярного сшивания белков для практических целей. Действительно, для каждого вновь взятого белка или при использовании нового гомологического ряда бифункциональных реагентов работу по подбору наилучшего сшивающего агента надо проводить заново.

Тем не менее, метод сшивок весьма полезен, поскольку позволяет получать водорастворимые стабилизированные производные ферментов с относительно низкой молекулярной массой (сравнимой с молекулярной массой самого фермента). Такие препараты предпочтительны в некоторых прикладных областях, в частности в медицине.