ЛАБОРАТОРНЫЕ ФЕРМЕНТАЦИОННЫЕ УСТАНОВКИ

Лабораторные ферментеры для культивирования микроорганизмов и ферментационные установки, оснащенные оборудованием, датчиками, контроллерами, находят в настоящее время широкое применение в исследовательской и производственной работе микробиологических предприятий.

Основой расчета технологических и конструктивных параметров промышленных биореакторов являются экспериментальные данные, получаемые на лабораторных и пилотных ферментационных установках. Применение лабораторных ферментационных установок позволяет решать следующие задачи:

- Проведение микробиологических селекционных работ по отбору более эффективных штаммов в процессе их культивирования;

- Оперативный анализ влияния качества сырья, минеральных солей, воды и других факторов на показатели роста микроорганизмов;

- Изучение воздействия на метаболизм клеток и технологические показатели процесса ферментации различных стимулирующих добавок;

- Уточнение в производственных условиях оптимальных параметров процесса культивирования (температура, рН среды, уровень аэрации и перемешивания и т.д.);

- Изучение кинетических и стехиометрических зависимостей различных штаммов микроорганизмов;

- Исследование влияния внешних факторов на качественный состав биомассы и продуктов вторичного метаболизма клеток.

Решение указанных задач в научно-исследовательских лабораториях и оперативная выдача рекомендаций непосредственно на производство позволяет значительно улучшить использование крупногабаритного производственного оборудования, повысить технико-экономические показатели предприятия.

Основные требования, которым должны отвечать лабораторные ферментационные установки, можно условно разделить на следующие:

- Требования к конструкции;

- Требования к технологической схеме, обеспечивающей возможность проведения заданного технологического режима и варьирование параметров процесса;

- Требования к измерительной и регулирующей части схемы.

Основой такой установки является биореактор-ферментер. Для лабораторных установок применяют аппараты объемом от 2 до 100 литров, преимущественно это ферментеры объемом 10 – 20 литров. Пилотные установки используют в основном ферментеры объемом 0,1 – 0,2 м³, при этом энергетические затраты на процесс ферментации не являются определяющим фактором при выборе типа и конструкции ферментера. Особенности используемого сырья, состава и физико-химических свойств сред, а также применяемых культур (например, наличие гиф у мицелиальных грибов) приводят к необходимости выбора ферментеров с альтернативными способами перемешивания и аэрации, но решаются такие задачи сравнительно просто. Поэтому могут быть использованы ферментеры различного типа, обеспечивающие необходимые требования по массопередаче кислорода, отсутствие застойных зон, а в ряде случаев «мягкое» гидродинамическое воздействие на клетки.

Технологическая схема обвязки ферментера предусматривает подачу в процесс необходимых компонентов питательной среды (соли, субстрат, вода), титрующего агента, аэрирующего газа и отбор суспензии на анализ. Особую проблему для целого ряда процессов микробиологического синтеза представляет задача создания и поддержания стерильных условий в процессе ферментации. Однако наибольшее распространение на практике получили ферментеры с механическим перемешиванием и барботажной аэрацией среды, обеспечивающее в объеме до 1000 л возможность широкого варьирования режима перемешивания и аэрации среды, а значит и показателей массопередачи. При этом сложность состоит в поддержании асептических условий. Наличие перемешивающих устройств с сальниковыми и торцевыми уплотнениями затрудняет решение этой задачи. В связи с этим более эффективно для стерильности применять аппараты с барботажем, например, колонного типа.

Другим специфичным вопросом является интенсивное пенообразование, сопровождающее процесс ферментации. В лабораторных установках наиболее часто используется принцип механического пеногашения, что позволяет не изменять физико-химические свойства среды, а следовательно, не влиять на кинетические и диффузионные процессы в ферментере.

Конструкционные особенности различных лабораторных установок связаны со спецификой процессов культивирования дрожжей, продуцентов антибиотиков, мицелиальных культур, микроводорослей, тканевых культур.

Особое место среди исследовательских ферментационных аппаратов занимают мембранные ферментеры.

На сегодняшний день мембранный биореактор является достаточно простым в техническом исполнении и перспективным с точки зрения расширения возможностей исследования и управления процессом ферментации, в котором развитие популяции происходит в постоянно обновляемой среде.

Это обновление осуществляется за счет постоянной подпитки субстратом и постоянного удаления метаболитов через полупроницаемую мембрану. В зависимости от типа мембраны различают три режима работы мембранных биореакторов: режим диализа, режим ультрафильтрации и режим микрофильтрации.

Сегодня уже накоплен достаточный опыт исследований и испытаний мембранных реакторов, который доказывает их перспективность. Однако исследования в этом новом для биотехнологии направлении пока не доведены до промышленных масштабов.

Существует две основные схемы мембранных биореакторов: со встроенной и вынесенной мембраной. Биореакторы со встроенной мембраной обычно представляют собой реакторы трубчатого типа, в которых поддерживают режим идеального вытеснения. Например, при ферментативном биосинтезе, субстрат с постоянным расходом, пропорциональным выходу продукта, подают в систему. Фермент, фактически иммобилизируется на мембране, которая свободно пропускает продукты реакции. В случае снижения активности катализатора в систему добавляют его новую порцию для поддержания скорости реакции на необходимом уровне. Степень задерживания мембраной фермента должна быть максимально высокой.

Установка с вынесенным мембранным аппаратом, в котором обычно поддерживают режим идеального смешения. Для таких реакторов характерно гомогенное распределение как катализатора, так и реагентов. Он работает при выходных концентрациях субстрата и продуктов и его продуктивность (производительность на единицу массы фермента) постоянна во времени.

Аппараты первого типа обычно трубчатые и концентрация субстрата в них уменьшается по длине реактора, а его продуктивность выше, так как он работает при более высоких концентрациях субстрата. Поэтому при необходимости получения максимальной конверсии субстрата процесс надо проводить в трубчатых реакторах идеального вытеснения. Повысить эффективность работы аппарата можно в каскаде мембранных реакторов:

1. С выводом продукта после каждого мембранного элемента;

2. С выводом продукта после конечного разделения;

3. С рециркуляцией на каждом мембранном элементе и общим выводом продукта.

Второй вариант каскада легко трансформируется в установку с одним трубчатым реактором. При тех же показателях уменьшается количество единиц оборудования, движущихся деталей, снижаются капитальные и текущие расходы, энергозатраты, облегчается обслуживание установки.

Важнейшим фактором с точки зрения работы трубчатого реактора является исключение в нем обратного перемешивания. Как известно, при низких скоростях реакционная среда в трубчатых реакторах движется как идеальный поршневой поток, поскольку отсутствует конвекционный перенос. Для выравнивания радиального концентрационного профиля используют различные турбулизирующие вставки. При хорошей организации работы один метр длины реактора может быть эквивалентен 5 – 40 смесительным ячейкам в зависимости от диаметра трубы.

В третьем случае каждый мембранный аппарат имеет циркуляционный контур, а конечный продукт собирается из всех параллельных аппаратов. В этом случае гораздо менее остро стоит проблема предварительной очистки потока субстрата от мелких механических примесей, которые не осаждаются на мембранах благодаря возможности создания в циркуляционных контурах любой требуемой гидродинамической обстановки. Возможна последующая регенерация фермента и субстрата. Такая схема весьма перспективна и в случае работы с высокомолекулярными субстратами, которые вместе с ферментом задерживаются мембраной. Поскольку контроль скорости конверсии субстрата затруднен, то в любой другой схеме сложно осуществить точную дозировку субстрата, которая не позволяла бы ему накапливаться в системе, но и не лимитировала бы скорость образования продукта.

Более прогрессивным решением является совмещение реактора и разделительной ячейки в единый аппарат. Однако в трубчатом мембранном аппарате возникает противоречие между необходимостью предотвращения обратного перемешивания снижением скорости протекания жидкости и необходимостью устранения отрицательного влияния концентрационной поляризации повышением скорости протекания. Преодолеть это противоречие можно, если разорвать связь между скоростями потока и реагирования веществ, что достигается в каскадной схеме трубчатых мембранных реакторов с постадийной рециркуляцией.

Исследовательские лабораторные мембранные установки должны отвечать следующим условиям:

Полное задержание клеток в объеме реактора, если он работает в режиме хемостата;

Длительное проведение процесса культивирования без снижения объемного расхода пермеата;

Возможность контролирования и поддержания постоянного объема среды;

Возможность регенерации и стерилизации мембран.

Как уже говорилось, все конструкции мембранных реакторов разделяют на аппараты с встроенной и выносной мембраной. Аппараты второй группы наиболее перспективны для промышленного использования, поскольку в них возможно применять промышленные мембранные модули известных конструкций с минимальными переделками, совмещенные со стандартными ферментерами. Преимуществом этой группы также является возможность развивать рабочую поверхность мембран до любой необходимой величины, а также создавать в контуре любой необходимый гидродинамический режим. Однако для исследовательских целей использовать аппараты второй группы нецелесообразно, поскольку во время нахождения среды в выносном контуре управлять процессом культивирования практически невозможно.

Мембранные аппараты первой группы можно рассмотреть на примере реакторов, разработанных в РХТУ им. Д.И. Менделеева. Это ферментеры «Елен-5», «Елен-6», «Елен-7», «Елен-9».

«Елен-5» и «Елен-6» снабжены мембраной, расположенной на нижнем фланце. Все необходимы датчики вводятся через штуцеры на верхнем фланце. Аэрация осуществляется через пористый барботер, к которому прикреплена магнитная мешалка, не касающаяся мембраны. Термостатирование осуществляется через погруженные змеевики. Ферментер «Елен-6» выполнен в виде конической камеры для увеличения удельной (на единицу объема среды) поверхности мембраны.

Ферментер Виестура объемом 5 литров позволяет более интенсивно перемешивать среду. Датчики вводятся через штуцеры на стенке нижнего стакана, мембрана выполнена в форме кольца. Ферментер снабжен термостатирующим устройством и механическим пеногасителем. Предусмотрена регенерация мембраны обратной продувкой сжатым воздухом. Основной недостаток конструкции – очень низкая удельная поверхность мембраны, поэтому ферментер рекомендовано использовать для работы в режиме микрофильтрации.

Принципиально иное решение предложено в ферментере Маргаритиса. Мембрана в этом аппарате расположена на вращающемся роторе, соединенном с нижним приводом. Это позволяет длительное время поддерживать удельную поверхность мембраны на высоком уровне. В объеме ферментера создается избыточное давление, достаточное для осуществления мембранного процесса. Ферментер должен быть снабжен внешним рециркуляционным контуром. Датчики расположены на стенках корпуса, для подачи воздуха используется кольцевой барботер. Недостатками аппарата являются низкая удельная производительность мембраны, плохое перемешивание среды и сложность конструкции. В значительной степени выше перечисленные недостатки устранены в аппаратах «Елен-7» и «Елен-9». В каждом из них высокая удельная поверхность мембраны и обеспечено интенсивное перемешивание среды.

Вращение мембранного элемента в аппарате «Елен-9» позволяет длительное время сохранять удельную производительность мембраны. Оба аппарата снабжены комплектом измерительной аппаратуры и системой термостатирования. Отвод пермеата из внутреннего перфорированного стакана осуществляется по трубке, опущенной до его дна. Аэрирующий воздух подается через кольцевой барботер. Мешалка на первом аппарате используется магнитная, во втором – турбинная, закрепленная на роторе.

Тип выбранной мембраны осуществляется способом культивирования. Для режима диализа используют обычные диализные мембраны из регенерируемой целлюлозы, которые хорошо задерживают высокомолекулярные соединения – ферменты, токсины, но пропускают сахара и соли. Для диализа можно использовать микропористые мембраны с размером пор до 25 нм. Их изготавливают из ацетата целлюлозы, керамики, пористого металла и стекла, асбеста. Наконец, в режиме диализа можно использовать чисто диффузионные непористые мембраны из силиконовой резины или тефлона.

Для режима ультрафильтрации используют выпускаемые промышленные мембраны из ацетата целлюлозы, полиамида, полисульфонамида и этилцеллюлозы. Для режима микрофильтрации можно применять серийные отечественные мембраны из нитрата целлюлозы, поливинилхлорида, фторопласта, поликарбоната.

При выборе материала мембраны следует учитывать прежде всего эго совместимость с культурой-продуцентом, поскольку сам материал может быть субстратом. Важным обстоятельством является отсутствие ингибирующих веществ в материале мембраны. Резко ограничивает выбор мембран их способность сохранять свои свойства после неоднократной термической или химической стерилизации. Необходимо так же принимать в расчет механическую прочность и удельную производительность мембран. В любом случае следует провести экспериментальное культивирование на малых объемах с мембраной и в ее отсутствии.

Принципиально иным использованием мембранной техники и процесса микробиологического синтеза является иммобилизация клеток в пористых мембранах, прежде всего в пористых волокнах. Метод заключается в абсорбционном связывании клеток продуцента в порах анизотропных полых волокон и прокачивании через волокна питательной смеси. За время прохождения субстрата вдоль волокна происходит его микробиологическая трансформация и с другой стороны выводится поток, обогащенный продуктом. Подача кислорода осуществляется путем предварительного насыщения питательной среды.

Разновидностями метода являются подача субстрата с наружной стороны волокон, проникновение его через поры в каналы и отвод из них продукта. Кислород при этом может подаваться импульсами внутрь пучка волокон. Возможен также отвод продуктов с наружной стороны волокон после из проникновения через мембрану, если молекулярная масса продуктов значительно меньше, чем у субстрата.

ВОПРОС №2. ЛАБОРАТОРНЫЕ УСТАНОВКИ «ФЕРМЕНТЕР – КОНТРОЛЛЕР»

Конструктивные особенности лабораторных установок, характеризующие надежность проведения процесса и удобство варьирования основных технологических параметров, являются скорее необходимым требованием, чем достаточным. Требования, предъявляемые к исследовательским ферментационным установкам, заключаются в наличии системы сбора данных о процессе и ее переработки с целью контроля и управления ферментацией. Таким образом, оснащенность ферментеров датчиками, автоматическими пробоотборниками, локальными контурами управления параметрами процесса, а также связью с управляющими контроллерами является тем критерием, по которому целесообразно оценивать совершенство лабораторных ферментационных установок. Такая информационная оснащенность установок позволяет с большой достоверностью и в более короткие сроки получать необходимые экспериментальные данные для различных математических моделей, расчета производственных биореакторов и прогнозирования технологических режимов ферментации в них.

Таким образом, отвечающая рассмотренным выше требованиям лабораторная установка должна иметь в качестве одного из основных - блок измерения, регулирования и управления параметрами процесса.