Использование протопластов в селекции растений

Протопласт – это содержимое растительной или бактериальной клетки, за исключением внешней клеточной оболочки (клеточной стенки), однако вместе с клеточной (плазматической) мембраной.

Сегодня мы знаем, что многие изолированные клетки, если их культивировать в соответствующих условиях, могут регенерировать в целое растение. Клетка, обладающая такой способностью к росту и формированию ткани, из которой затем развивается полноценное растение, называется тотипотентной. В середине 60-х годов тотипотентность клеток была обнаружена у многих видов растений.

Из тотипотентных клеток легко получить лишенные клеточной стенки протопласты. Разработаны методы их культивирования для получения каллусной ткани и затем небольших растеньиц, которых можно размножать обычными способами. Протопласты получены из тканей большинства органов растений, в том числе из корней, листьев, лепестков, плодов, колеоптил, запасающих органов, тетрад микроспор (из пыльников), корневых клубеньков бобовых и каллусных тканей. Чаще всего для этого берут мезофильную ткань листа: из нее образуется много единообразных протопластов. Нередко из протопластов получают каллусные культуры, из которых можно регенерировать целое растение.

Зрелый, сформировавшийся лист отделяют от взрослого растения в возрасте 60 - 80 дней, окунают в 70% этанол, а затем помещают на 15 - 20 минут в 10% раствор гипохлорита кальция и многократно промывают дистиллированной водой. С помощью пинцета нижний эпидермис снимают, очищенные от эпидермиса листья разрезают скальпелем на небольшие кусочки площадью 4 кв. см. Для лучшего снятия эпидермиса листья должны немного подвянуть, можно также ограничить снабжение водой перед срезанием листьев.

Далее ткань обрабатывают последовательно или одновременно пектиназой, вызывающей мацерацию, и целлюлазой, разрушающей клеточные стенки. Оптимальная концентрация ферментов, как и время обработки, индивидуальны для разных тканей. Протопласты должны находиться в растворе ферментов минимальное количество времени, после чего следует тщательная промывка. Ферменты стерилизуют через бактериальные фильтры.

Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Когда протопласт "голый", один из компонентов регуляции водообмена теряется, поэтому важное значение приобретают осмотические свойства среды выделения и культивирования. Среда должна быть немного гипертонической, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии. Эти условия тормозят метаболизм и регенерацию клеточной стенки. В качестве осмотических стабилизаторов используют сахара (глюкозу, маннит, сорбит, ксилозу), ионные осмотики (CaCl₂, KCl) в концентрации 0,3 - 0,8 моль/литр. Концентрации подбираются индивидуально для каждого растительного объекта.

Удобнее обрабатывать ткани ферментами в чашке Петри, которую держат под углом 15°. Смесь ферментов с протопластами переносят в центрифужные пробирки. Отделить протопласты от ферментативной смеси можно двумя способами: либо фильтрация с центрифугированием, либо флотация.

При фильтрации смесь пропускают через фильтры с размерами пор 40 мкм. На фильтре при этом остаются комки клеток и их большие осколки. При дальнейшем центрифугировании оседают протопласты, осколки остаются в супернатанте. При повторном центрифугировании идет отмывка от фермента, после чего протопласты переносятся в среду для культивирования.

Метод флотации предложен О. Гамборгом с сотрудниками в 1981 году, и предназначается для ослабленных протопластов. Он основан на том, что протопласты имеют более низкую плотность, чем органеллы или остатки клеточных стенок. К исходной смеси добавляют раствор сахарозы и центрифугируют при скорости от 40 – 80 до 350 g. Чистые протопласты плавают, осколки оседают на дно.

Протопласты можно выделять также из суспензионных и клеточных культур. Лучше всего - в поздней стадии логарифмического роста, когда клеточные стенки легче поддаются разрушению, протопласты наиболее жизнеспособны.

Далее протопласты культивируют в тех же условиях, что и клетки. Состав солей может быть несколько изменен. Среда состоит из осмотического стабилизатора, неорганических соединений, источника углерода, азота, витаминов, фитогормонов. Условия культивирования: рН среды 5,4 - 5,8, температура 22 - 28°С, невысокая освещенность.

Использование протопластов, помимо разведения чистых культур, открывает возможность создания гибридных организмов. Для осуществления гибридизации соматических клеток методом слияния протопластов необходимо выполнить следующие операции:

- выделить протопласты;

- осуществить слияние;

- регенерировать клеточные стенки;

- осуществить слияние ядер так, чтобы получить полноценное гибридное ядро;

- размножить гибридные клетки;

- регенерировать целое растение.

Хотя о возможности слияния протопластов растений было известно уже давно, метод контролируемого слияния с воспроизводимыми результатами был разработан лишь в 1970 г. Тем самым был сделан первый шаг к соматической гибридизации растений. При суспендировании протопластов в 0,25М растворе азотнокислого натрия слияние происходило очень быстро. Впоследствии для индукции слияния протопластов использовали 10,2%-ный раствор сахарозы, содержащий 5‚5% азотнокислого натрия. Для той же цели применяли хлористый кальций.

Осуществить слияние протопластов растений, вообще говоря, несложно, но из этого не следует, что столь же просто размножить гибридные клетки или же регенерировать гибридное растение. Прежде всего, нужно отобрать гибридные протопласты, которые составляют лишь малую часть всех клеток, а затем создать им условия для развития. Слияние протопластов открывает возможность по получению мутантных растений с заданными свойствами. В опытах в протопласты растений была введена чужеродная ДНК, которая экспрессировалась и из протоклонов были получены мутантные растения.

Биопестициды

Использование микроорганизмов в качестве биопестицидов - сравнительно новое направление биотехнологии, но уже имеющее существенные достижения. В настоящее время бактерии, грибы, вирусы находят все более широкое применение в качестве промышленных биопестицидов. Технология производства этих препаратов весьма различна, как различна природа и физиологические особенности микроорганизмов-продуцентов. Однако имеется ряд универсальных требований, предъявляемых к биопестицидам, основными среди них являются: селективность и высокая эффективность действия, безопасность для человека и полезных представителей флоры и фауны, длительная сохранность и удобство применения, хорошая смачиваемость и прилипаемость. В настоящее время для защиты растений и животных от насекомых и грызунов применяются, помимо антибиотиков, около 50 микробных препаратов, относящихся к трем группам: это бактериальные, грибные и вирусные препараты.

К настоящему времени описано свыше 90 видов бактерий, инфицирующих насекомых. Большая их часть принадлежит к семействам Pseudomonadaceae, Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae, Micrococcaceae, Bacillaceae. Большинство промышленных штаммов принадлежит к роду Bacillus, и основная масса препаратов (свыше 90 %) изготовлена на основе Bacillus thuringiensis (Bt). Штаммы Bt используют для борьбы с различными вредителями - гусеницами, комарами, мошкой. Препараты на основе Bt относятся к токсинам кишечного действия. Типичными последствиями их воздействия являются паралич кишечника, прекращение питания, развитие общего паралича и гибель насекомого.

Технология получения биопестицидов на основе энтомопатогенных бактерий представляет собой типичный пример периодической гомогенной аэробной глубинной культуры, реализующейся в строго стерильных и контролируемых условиях. Цель процесса - получение максимального урожая бактерий и накопление токсина. Основу питательной среды составляет дрожжеполисахаридная смесь и пеногаситель (кашалотовый жир). Длительность ферментации при 28 - 30°С в режиме перемешивания и аэрации составляет 35 - 40 часов до накопления в культуральной жидкости 5 - 10% свободных спор и кристаллов от общего их количества (при титре культуры не менее 1 млрд. спор в 1 мл). Далее споры и кристаллы отделяются в процессе сепарирования и обезвоживаются. Товарная форма препарата - сухой порошок, а также стабилизированная паста. Выход пасты при влажности 85% и титре около 20 млрд. спор/г – около 100 г/м³ культуральной жидкости. Стабилизация пасты осуществляется смешиванием ее с карбоксиметилцеллюлозой, обладающей высокой сорбционной емкостью. Споры и кристаллы в результате стабилизации образуют трехмерную сетчатую структуру, в которую равномерно проникает консервант, обеспечивая длительную сохранность препарата. На основе пасты в процессе высушивания в распылительной сушилке получают сухой продукт с остаточной влажностью не выше 10% и с титром 100 - 150 млрд. спор/г. Препарат усредняется и стабилизируется каолином. Готовый сухой продукт содержит до 30 млрд. спор/г.

Первый отечественный препарат получен на основе Bacillus thuringiensis - энтобактерин.

Многочисленные виды энтомопатогенных грибов широко распространены в природе. Они поражают широкий круг насекомых, обладая для этого различными механизмами, включая контактный, что облегчает их применение. Грибы хорошо сохраняются в виде спор и продуцируют разнообразные биологически активные вещества, усиливающие их патогенность. Однако грибные препараты не применяются пока достаточно широко. Это связано, во-первых, с определенными технологическими трудностями, возникающими при их культивировании и, во-вторых, - обусловлено жесткими требованиями к факторам окружающей среды(высокая активность грибных препаратов проявляется только в условиях высокой и стабильной влажности).

Metarhizium anisopliae -наиболее известный энтомопатогенный гриб, описанный более 100 лет назад как зеленый мускаридный гриб. На его основе были получены первые препараты биопестицидов в промышленных масштабах. Этот гриб поражает многие группы насекомых, включая слюнного пастбищного клопа и вредителя сахарного тростника. В сочетании с вирусом препарат данного гриба используют для контроля численности жука-носорога, являющегося главным вредителем пальм на островах в южной части Тихого океана. Есть данные о том, что с его помощью можно бороться с коричневой цикадой - вредителем риса.

Verticilium lecanii является единственным грибным энтомопатогеном, на основе которого на западе успешно выпускают препараты в промышленных масштабах. Его изучение началось в начале 80-х годов. Этот организм способен контролировать в оранжереях численность тлей и алейроцид в течение нескольких месяцев.

Боверин является отечественным грибным препаратом, который изготавливают на основе конидиоспор Beauveria bassiana. Препарат выпускают в виде порошка с титром 2 - 6 млрд. конидиоспор/г. Применяют также в комплексе с химическими препаратами при уменьшение дозы последних в 10 раз от принятой нормы для индивидуального химического пестицида. Боверин почти также эффективен, как лучшие из доступных химических пестицидов. После заражения насекомого B. bassiana выделяет боверицин, циклодепсипептид-токсин. Боверин безопасен для человека и теплокровных, не вызывает ожогов у растений.

Получение боверина возможно как экстенсивным поверхностным, так и более экономичным глубинным способом ферментации. Последний, однако, является достаточно трудной технико-технологической задачей. При глубинной ферментации гриб размножается вегетативно, образуя гифальные тельца (гонидии), которые по действию близки воздушным конидиям, но уступают им в устойчивости (в процессе распылительного высушивания до 90 % гонидиоспор погибает). Конидиоспоры удается получать в глубинной культуре на основе оптимизированной питательной среды.

Поверхностное культивирование гриба требует больших производственных площадей и более трудоемко, поэтому имеет меньшие масштабы. Способ реализуется в разных вариантах: на жидкой среде без соблюдения правил стерильности, аэрации и перемешивания; на твердой среде или жидкой среде в условиях асептики и комбинированным способом пленки. При твердофазной ферментации с использованием сусло-агара, картофеля, зерна пшеницы или кукурузы образование конидиоспор завершается на 12 - 15 сутки. На жидких средах образование спор наблюдается через 7 - 10 суток, а на 18 - 25 сутки сформированную спороносную пленку снимают. Полученный материал высушивают, размалывают и смешивают с тальком или торфом. Производительность метода– до 800 кг в месяц.

Весьма перспективны для защиты растений энтомопатогенные вирусы. Вирусы чрезвычайно контагиозны и вирулентны, узко специфичны по действию, хорошо сохраняются в природе вне организма-хозяина. Эти препараты вследствие высочайшей специфичности практически полностью безопасны для человека и окружающей среды. Заражаются насекомые вирусами при питании. Попавшие в кишечник тельца-включения разрушаются в щелочной среде. Освободившиеся вирионы проникают через стенку кишечника в клетки и реплицируются в ядрах.

Вирусы способны размножаться только в живой ткани организма-хозяина. Это обстоятельство делает очень трудоемкой процедуру получения вирусного материала в значительных количествах. Получают вирусный материал при размножении вирусов в насекомых. После гибели насекомых их массу измельчают, затем выделяют вирусный материал и подвергают очистке. На определенной стадии развития насекомое заражают, добавляя суспензию вирусов в корм. Спустя 7 - 9 суток погибших гусениц собирают, высушивают и измельчают. В измельченную массу добавляют физиологический раствор (1 мл на 1 гусеницу), взвесь фильтруют. Осадок суспендируют в небольшом количестве физиологического раствора и заливают глицерином. Препарат стандартизуют (титр 1 млрд. полиэдров/мл) и разливают во флаконы. Одна зрелая гусеница способна дать до 36 млрд. телец-включений, что составляет до 30% ее массы. Препараты готовят в виде дустов, суспензий и масляных форм. При получении сухого препарата вирусный материал смешивают с каолином; для получения масляной формы осадок смешивают с 50% раствором глицерина до титра 2 млрд. полиэдров/г.

Видовое название энтомопатогенных вирусов состоит из группового названия и поражаемого хозяина(например, «полиэдроз непарного шелкопряда» или«полиэдроз американской бабочки»). Отечественной промышленностью выпускается несколько вирусных препаратов; в том числе «вирин-ГЯП» (против гусеницы яблоневой плодожорки), «вирин-КШ» (против кольчатого шелкопряда), «вирин-ЭНШ» (против непарного шелкопряда), «вирин-ЭКС» (против капустной совки). В США усовершенствован процесс производства нескольких вирусных препаратов для защиты лесов («ТМ-Биоконтрол» и «Циптек»). Вследствие достаточной трудоемкости производства эти препараты пока не нашли массового применения. Специалисты считают, что потребуются годы, чтобы вирусные препараты смогли занять значительное место на рынке биопестицидов.